Fluorescent Microspheres in Biomedicine

荧光微球是指粒径在纳米到微米(0.01-10μm范围内)负载荧光物质的固体颗粒，受外界能量刺激后能发射荧光。侧向流分析(LFA)近年来发展迅速，具有简便、快速、不依赖于大型仪器设备、成本低廉等优点，在实时检测、现场检测、家庭自检等方面有着广泛的应用。

荧光微球作为一种特殊的功能微球，不仅具备无机和有机物质的性质，而且在外界能量刺激下还能发出荧光。近来研制的荧光微球粒径均匀，单分散性好，稳定性好，发光效率高。微球表面曲率有利于抗原决定簇与抗体结合位点的暴露表面达到最佳反应状态。

因此在生物化学、生物医药、临床医学、基因分析、光学仪器等诸多领域有着广泛的应用，其中荧光微球在医学和生物学领域的应用尤为重要，荧光微球在微球上的负载方式可分为溶胀吸附法、包埋法、化学键合法、共聚法等四种。

01 标记和追踪应用

在聚合物微球表面或内部引入一种或多种荧光物质制备的荧光微球，最初作为校准流式细胞仪、荧光显微镜的荧光标准微球，逐渐应用于细胞标记、生物分子标记及活性条件下的示踪，还可固定蛋白质分子并追踪其功能化过程。

将带有能与表面分析物结合的配体的荧光微球与放射性标记的分析物混合，体系中能与微球结合的分析物可以被它们的辐射激发产生荧光，而不能与微球结合的分析物由于距离较远而浸没在水中，不能被它们的辐射激发，从而可以检测未分离的产品。

而且荧光微球可携带较多荧光分子，较弱的刺激即可引发较强的信号，因此只需要少量的低能辐射就能产生荧光信号，避免了使用传统放射性微球带来的放射线危害，在不损失检测灵敏度的情况下降低了成本。

目前荧光微球应用最为广泛、前景广阔的是生物医学领域，国外工业化的荧光微球主要应用于此领域。主要包括高通量免疫检测、药物筛选、固定化酶等。荧光微球可以实现对多种微生物的灵敏、快速、高效的检测。羧基化的荧光微球可以与单克隆抗体共价偶联，通过双抗体夹心反应模式制备相应的荧光微球免疫层析试纸条进行检测。

荧光微球在生物样本检测中作为不同检测靶标的固定化载体，通过物理吸附或共价结合的方式与抗体或抗原结合，通过凝集试验检测出体液中相应的抗原或抗体。该方法由于操作简便、灵敏度高，在早期被广泛应用，而不同的荧光微球对应不同的捕获抗体，可以识别不同的抗原，实现对多种检测抗原的定性定量检测。

酶可通过物理吸附或化学键合的方式固定在荧光微球上，由于酶固定的三维形貌，不仅具有较高的pH稳定性、热稳定性、储存稳定性，而且易于与反应物分离，可重复使用，提高效率。

因此将酶或其他生物活性物质固定在微球载体上更有利于其功能发挥；同时，荧光微球还可以通过物理吸附或化学键合的方式与基因等靶标连接，将这些靶标与相应的标记物结合，即可进行检测分析。

此外，由于荧光微球具有稳定的形貌结构和高效的发光效率，还可作为校准光学仪器的标准。

时间分辨荧光免疫分析是当代最先进的免疫分析方法之一，结合纳米信号的放大效应，具有广阔的应用前景，适用于开发肿瘤标志物、激素等因子的高灵敏免疫检测试剂盒。

由于稀土离子本身的发光效率较低，当稀土离子与吸收系数大的配体形成配合物时，配体吸收激光跃迁到激发态，将能量转移给稀土离子，稀土离子接受到转移的能量后，被激发到共振能级，在跃迁回基态的过程中发射荧光，表现出强烈的稀土离子特征荧光。

基于上述微球结构及发光机理，时间分辨荧光微球与普通荧光微球相比，具有以下特点：

（1）内部嵌入工艺——无染料表面，易于耦合

（2）荧光强度——高于普通的红色或绿色荧光微球

（3）斯托克斯位移——比普通荧光微球大（大多在250nm以上）

（4）半衰期——荧光寿命长，抗干扰能力强

时间分辨的荧光寿命通常在100μs以上，比普通荧光微球的荧光寿命高出几个数量级。这是因为稀土配合物的发光是由配体激发态的能量转移引起的

（5）稳定性——稀土离子配合物比普通荧光稳定性更高，批次间差异更稳定

目前最常见的时间分辨荧光微球是嵌入稀土元素铕（Eu）的时间分辨荧光微球，主要用于开发荧光定量免疫层析试纸条，用于POCT快速检测、食品安全检测（包括农药残留、药物等）等，与荧光定量检测仪联用，可实现不同指标的快速定量检测。