Двухцветные флуоресцентные микросферы 5 мкм 0,5%

Проточная цитометрия Абсолютный счет флуоресцентных микросфер

Флуоресцентные микросферы для абсолютного подсчета проточной цитометрии SHBC представляют собой двойные флуоресцентные эталонные частицы, разработанные для абсолютного подсчета клеток, проточного цитометрического иммунофенотипирования, анализа иммунных клеток и исследований по количественному подсчету частиц.

Микросферы Double-Fluo имеют два канала обнаружения флуоресценции:

• Возбуждение примерно при 488 нм с центром эмиссии около 530 нм.

• Возбуждение примерно при 633 нм с центром эмиссии около 670 нм.

Микросферы поставляются в виде водной суспензии с содержанием сухих веществ 0,5%.

Профиль флуоресценции с двойным лазером и двойной эмиссией позволяет идентифицировать микросферы с использованием каналов как синего, так и красного лазера на совместимых проточных цитометрах. Когда известный объем микросфер с определенной для партии анализируемой концентрацией частиц добавляется к известному объему образца, абсолютная концентрация клеток или других частиц может быть рассчитана по отношению событий образца к событиям микросфер.

Этот продукт предназначен для исследовательских учреждений, лабораторий проточной цитометрии, разработчиков реагентов для иммунофенотипирования, компаний и производителей антител, которым требуются образцы для разработки, пилотные количества или оптовая поставка флуоресцентных микросфер.

Обзор продукта

Проточная цитометрия обычно показывает процент клеток в выбранной популяции. Однако во многих исследовательских приложениях также требуется фактическое количество клеток на микролитр, миллилитр или исходный объем образца.

Микросферы для абсолютного счета обеспечивают внутренний эталон частиц для этого расчета.

Известный объем счетных микросфер добавляется непосредственно к образцу клеток. Затем проточный цитометр записывает события с клетками-мишенями и событиями с микросферами во время того же сбора данных.

Поскольку концентрация микросфер известна, количество клеток в исходном образце можно рассчитать по соотношению между двумя популяциями событий.

Микросферы Double-Fluo обеспечивают два флуоресцентных ответа для идентификации микросфер:

• Зеленая флуоресценция около 530 нм при возбуждении примерно 488 нм.

• Дальнекрасная флуоресценция около 670 нм при возбуждении примерно 633 нм.

Двойной флуоресцентный профиль может помочь пользователям:

• Отличие счетных микросфер от неокрашенных клеток

• Отделение микросфер от клеточного мусора

• Подтвердите идентичность микросфер по двум каналам флуоресценции.

• Уменьшить зависимость только от параметров разброса

• Создайте компактный и воспроизводимый микросферный гейт.

• Поддержка проточных цитометров, оснащенных синими и красными лазерами.

• Разработка индивидуальных реагентов для абсолютного счета

• Улучшить внутренний сбор данных и контроль процессов

Микросферы можно оценивать с использованием цельной крови, лизированной цельной крови, мононуклеарных клеток периферической крови, культивируемых клеток, изолированных иммунных клеток и других суспензий частиц.

Совместимость должна быть проверена с использованием предполагаемой матрицы образца, панели антител, цитометра и рабочего процесса анализа данных.

Ключевые особенности микросфер двойного фтора

Двойное возбуждение при 488 нм и 633 нм

Микросферы Double-Fluo предназначены для возбуждения с использованием двух распространенных лазерных линий проточных цитометров:

• Возбуждение синим лазером примерно 488 нм

• Возбуждение красным лазером примерно 633 нм

Возбуждение длиной волны 488 нм обеспечивает зеленую флуоресцентную реакцию, которую можно обнаружить вблизи длины волны 530 нм.

Возбуждение с длиной волны 633 нм обеспечивает флуоресцентный ответ в дальнем красном диапазоне, который можно обнаружить вблизи длины волны 670 нм.

Эта конструкция с двумя лазерами поддерживает проточные цитометры, оснащенные как синими, так и красными лазерными модулями, и позволяет разработчикам реагентов выбирать один или оба сигнала флуоресценции для идентификации микросфер.

Также могут быть оценены инструменты, использующие красные лазеры с длиной волны 635 или 640 нм. Окончательная совместимость зависит от мощности лазера, конфигурации фильтра, чувствительности детектора и спектра флуоресценции конкретной партии.

Двойное излучение при 530 нм и 670 нм

Номинальные каналы излучения флуоресценции:

• Примерно 530 нм после возбуждения 488 нм.

• Примерно 670 нм после возбуждения 633 нм.

Сигнал 530 нм обычно находится в области обнаружения зеленой флуоресценции.

Сигнал 670 нм расположен в дальней красной области обнаружения флуоресценции.

Два сигнала флуоресценции можно использовать по отдельности или вместе в соответствии с конфигурацией панели антител и цитометра.

Двойной флуоресцентный гейт может обеспечить дополнительный метод отличия счетных микросфер от:

• Неокрашенные клетки

• Фрагменты клеток

• Тромбоциты

• Электронный шум

• Автофлуоресцентные события

• Одноканальные флуоресцентные частицы

• Неспецифические примеси проб

Точные длины волн и полосы пропускания центра фильтра должны быть проверены на предполагаемом проточном цитометре.

0,5% водная суспензия твердых веществ

Продукт поставляется с содержанием сухих веществ 0,5%.

Если выразить массу на объем, 0,5% твердых веществ соответствует примерно 5 мг микросфер на миллилитр.

Содержание твердых веществ полезно для:

• Контроль производственного процесса

• Разработка рецептуры

• Расчеты разбавления

• Сравнение масс между партиями

• Индивидуальная подготовка концентрации

• Контроль процесса розлива

Однако содержание твердых веществ не совпадает с числовой концентрацией частиц, необходимой для абсолютного подсчета.

Концентрация шариков в зависимости от партии

Для надежного абсолютного подсчета требуется определенная для партии количественная концентрация анализируемых частиц, определяемая как:

• Шариков/мл

• Бисер/мкл

• Шариков на рекомендуемый тестовый объем

Числовая концентрация гранул должна быть измерена с использованием проверенного метода подсчета частиц и указана на этикетке продукта или в сертификате анализа.

Это значение используется при расчете абсолютного количества ячеек.

Важные элементы управления включают в себя:

• Числовая концентрация частиц

• Допуск по концентрации

• Точность заполнения

• Консистенция от бутылки к бутылке

• Однородность суспензии

• Воспроизводимость отбора проб

• Стабильность при хранении

• Стабильность после транспортировки

Коммерческие продукты для абсолютного подсчета аналогичным образом основаны на калиброванных или специфичных для партии концентрациях микросфер, а не только на содержании твердых веществ.

Равномерный размер частиц

Контролируемый размер частиц помогает создать компактную популяцию микросфер на графиках прямого и бокового рассеяния.

Узкое распределение частиц по размерам может улучшить:

• Воспроизводимость стробирования

• Идентификация событий

• Перенос между инструментами

• Постоянство выборки

• Дублетная дискриминация

• Сравнение партий с партиями

• Автоматизированный анализ данных

Номинальный размер частиц и допустимый диапазон размеров должны быть указаны в окончательной спецификации продукта.

Равномерная интенсивность двойной флуоресценции

Постоянная интенсивность флуоресценции в обоих каналах помогает создать четко разделенные ворота микросфер.

Рекомендуемые характеристики качества флуоресценции включают:

• Средняя интенсивность зеленой флуоресценции

• Коэффициент вариации зеленой флуоресценции

• Средняя интенсивность флуоресценции в дальнем красном диапазоне

• Коэффициент вариации дальнекрасной флуоресценции

• Процент двойных положительных микросфер

• Соотношение зеленой и дальней красной флуоресценции

• Стабильность флуоресценции при хранении

• Обнаруживаемость между приборами

Два сигнала флуоресценции должны быть достаточно отделены от предполагаемых популяций клеток и конъюгатов антител.

Внутренняя флуоресцентная маркировка

Флуоресцентные красители встроены в структуру микросфер, а не полагаются только на слабую поверхностную адсорбцию.

Внутренняя флуоресцентная маркировка может помочь:

• Уменьшите потерю красителя

• Улучшить устойчивость к стирке

• Поддерживайте стабильную внешнюю поверхность

• Защитите флуоресцентный материал

• Повышение стабильности хранения

• Поддержка долгосрочной разработки реагентов

• Уменьшите колебания флуоресценции от партии к партии

Готовый продукт все равно следует беречь от длительного воздействия яркого света.

Одноплатформенный абсолютный подсчет

Микросферы и клетки-мишени получают во время одного и того же сеанса проточной цитометрии.

Это позволяет пользователю рассчитывать концентрацию клеток, не полагаясь исключительно на отдельный гематологический анализатор или внешний счетчик частиц.

Метод единой платформы может уменьшить вариации, возникающие за счет передачи процентных результатов между разными инструментами. Официальные продукты для счетных бусин от Thermo Fisher и Beckman Coulter используют тот же принцип соотношения.

Подходит для разработки реагентов и массового производства

Микросферы SHBC Double-Fluo предназначены для клиентов, которым требуется нечто большее, чем небольшой исследовательский пакет.

Доступные этапы проекта могут включать в себя:

• Первоначальная оценка микросфер

• Тестирование совместимости проточного цитометра

• Разработка стробирующего метода

• Разработка реагентов с абсолютным числом

• Тестирование на совместимость панели антител

• Пилотное производство

• Исследования стабильности

• Проверка процесса

• Массовое производство

• Бронирование лота

• OEM и ODM производство

Технические характеристики

Следующая информация должна быть подтверждена и добавлена ​​до официальной публикации:

• Каталожный номер

• Номинальный размер частиц

• Допуск на размер частиц

• Микросферная матрица

• Гранулы для конкретной партии/мл

• Допуск по концентрации количества частиц

• Подвесной буфер

• ПАВ

• консервант

• Размер упаковки

• Температура хранения

• Срок годности

Содержание твердых веществ в зависимости от концентрации количества шариков

Содержание твердых веществ и концентрация частиц описывают различные свойства продукта.

Что означает 0,5% твердых частиц?

Суспензия с концентрацией 0,5% по объему содержит примерно:

5 мг микросфер на миллилитр

Содержание твердых веществ описывает общую массу материала микросфер в данном объеме.

Это полезно для производства, разбавления и контроля рецептуры.

Что означает «Бусы/мл»?

Бусы/мл характеризуют количество отдельных микросфер в одном миллилитре.

Это значение зависит от:

• Диаметр микросферы

• Плотность частиц

• Распределение частиц по размерам

• Концентрация твердых веществ

• Совокупный уровень

• Метод подсчета частиц

Два микросферических продукта могут иметь одинаковое содержание твердых веществ 0,5%, но очень разные значения количества шариков на мл, если их размеры частиц различаются.

Какое значение используется для абсолютного счета?

Формула абсолютного подсчета клеток требует калиброванной концентрации частиц, а не только содержания твердых веществ.

Поэтому в сертификате подлинности должны быть указаны концентрации для конкретной партии, такие как:

• 8,5 × 10⁵ шариков/мл

• 1,0 × 10⁶ шариков/мл

• Указанное количество шариков на рекомендуемый объем теста

Приведенные выше примеры иллюстрируют только форматы отчетов и не являются спецификациями продукта.

Как работают микросферы с абсолютным счетом

Известный объем микросфер Double-Fluo добавляется к известному объему образца.

Во время сбора данных проточный цитометр записывает:

• Количество событий клеток-мишеней

• Число событий счетной микросферы

Поскольку количество микросфер, добавленных в пробирку, известно, исходную концентрацию клеток-мишеней можно рассчитать по соотношению событий.

Типичный процесс включает в себя:

1. Подготовьте или окрасьте образец клеток.

2. При необходимости лизируйте эритроциты.

3. Тщательно перемешайте суспензию счетных микросфер.

4. Добавьте точно отмеренный объем микросфер.

5. Получите образец, не теряя клеток или микросфер.

6. Ворота популяции клеток-мишеней.

7. Ворота в популяцию двойных флюо-микросфер.

8. Запишите номера событий клеток и микросфер.

9. Рассчитайте абсолютную концентрацию клеток.

10. Примените любой необходимый коэффициент разбавления образца.

Формула расчета абсолютного количества клеток

Общий расчет такой:

Абсолютная концентрация клеток = События в клетках ÷ События в шариках × Концентрация шариков × Объем шариков ÷ Объём образца × Коэффициент разведения

Когда результат выражается в клетках на микролитр:

Клеток/мкл = (События в клетках / События в шариках) × Концентрация шариков в шариках/мкл × (Объём шарика / Объём образца) × Коэффициент разведения

Где:

• События ячейки — это события внутри проверенного шлюза целевой ячейки.

• События с шариками — это события внутри проверенных ворот двойной флюо-микросферы.

• Концентрация шариков — это значение для конкретной партии, указанное в сертификате подлинности.

• Объем шариков — это фактический объем добавленной суспензии шариков.

• Объем выборки — это исходный объем выборки, используемый для расчета.

• Коэффициент разбавления учитывает любое применимое разбавление.

Упрощенный расчет

Когда объемы шариков и образца равны:

Клеток/мкл = События в клетках ÷ События в шариках × Концентрация шариков в шариках/мкл

Эта упрощенная формула действительна только в том случае, если схема подготовки проб поддерживает это предположение.

Методы счетных шариков Thermo Fisher и Beckman Coulter используют одно и то же основное соотношение между событиями в клетках-мишенях и событиями в анализируемых микросферах.

Зачем использовать счетные микросферы с двойным фтором?

Подтвердите идентичность микросферы по двум каналам

Подсчетная популяция, определенная с использованием только рассеяния или одного флуоресцентного сигнала, может перекрываться с остатками образца или другими флуоресцентными событиями.

Двойная флуоресцентная сигнатура обеспечивает дополнительный уровень идентификации микросфер.

Возможные варианты ворот включают в себя:

• Только флуоресценция 530 нм

• Только флуоресценция 670 нм

• 530 нм против 670 нм

• FSC против 530 нм

• SSC против 670 нм

• Двойное положительное стробирование микросфер

Уменьшить зависимость только от рассеяния

Разброс вперед и в сторону может варьироваться в зависимости от:

• Модель цитометра

• Лазерное выравнивание

• Напряжение детектора

• Пример матрицы

• Показатель преломления частиц

• Настройки порога

• Обслуживание приборов

Идентификация на основе флуоресценции может помочь обеспечить обнаружение микросфер, когда разделение рассеяния ограничено.

Поддержка инструментов с синим и красным лазером

Многие многоцветные проточные цитометры содержат как синий, так и красный лазеры.

Микросферы Double-Fluo позволяют производителям разрабатывать счетные реагенты, совместимые с:

• Обнаружение синего лазера

• Обнаружение красного лазера

• Двойное лазерное подтверждение

• Различные конфигурации фильтров

• Различные панели антител

Улучшить внутренний контроль качества

Когда установлено определенное соотношение двойной флуоресценции, пользователи могут отслеживать:

• Потеря одного сигнала флуоресценции

• Неправильное расположение ворот

• Отказ оптического канала

• Загрязнение образца

• Агрегация микросфер

• Ненормальное соотношение сигнала

• Изменения настроек прибора

Поддержка автоматического анализа

Компактная популяция микросфер с двойным положительным результатом может помочь упростить автоматическую идентификацию с помощью программного обеспечения для анализа.

Автоматизированное гейтирование по-прежнему должно быть проверено в следующих областях:

• Несколько лотов

• Несколько инструментов

• Несколько операторов

• Различные матрицы выборок

• Низкие и высокие концентрации клеток

Совместимость проточного цитометра и детектора

Синий лазерный канал

Номинальная конфигурация синего лазера:

• Возбуждение: примерно 488 нм

• Эмиссия: примерно 530 нм

Возможные первоначальные конфигурации детектора включают фильтры, расположенные вблизи области зеленой флуоресценции.

Фактическая полоса пропускания фильтра должна выбираться в соответствии со спектром микросфер и панелью антител.

Красный лазерный канал

Номинальная конфигурация красного лазера:

• Возбуждение: примерно 633 нм

• Эмиссия: примерно 670 нм

Приборы, использующие красные лазеры с длиной волны 635 или 640 нм, могут быть совместимы после проверки.

Рекомендации по панели антител

Канал 530 нм может перекрываться с обычными конъюгатами антител, излучающими зеленый цвет.

Канал 670 нм может перекрываться с дальнекрасными флуорофорами.

Во время разработки панели оцените:

• Перекрытие флуоресценции

• Спектральный перелив

• Требования к компенсации

• Насыщение детектора

• Яркость микросфер

• Интенсивность клеточного маркера

• Доступные неиспользуемые каналы

Ворота микросферы могут быть установлены с использованием канала, который обеспечивает наилучшее отделение от популяций окрашенных клеток.

Обычные и спектральные цитометры

Микросферы с двойным фтором можно оценивать на:

• Традиционные проточные цитометры с фильтрами

• Спектральные проточные цитометры

• Настольные проточные цитометры

• Автоматизированные анализаторы проточной цитометрии

• Платформы клеточного анализа с объемным отбором проб

• Исследовательские сортировщики клеток

Для спектральных цитометров необходимо измерить полную характеристику флуоресценции и при необходимости включить ее в справочную библиотеку.

Рекомендуемые приложения

Абсолютный подсчет иммунных клеток

Микросферы можно оценить по абсолютному подсчету:

• Всего лейкоцитов

• Т-клетки

• CD4-положительные Т-клетки

• CD8-положительные Т-клетки

• В-клетки

• Естественные клетки-киллеры

• Моноциты

• Гранулоциты

• Популяции дендритных клеток

• Другие подмножества закрытых иммунных клеток

Целевая популяция определяется с использованием утвержденной лабораторной панели антител и стратегии гейтирования.

Проточное цитометрическое иммунофенотипирование

Микросферы Double-Fluo можно добавлять в рабочие процессы иммунофенотипирования для преобразования процентного содержания клеток в абсолютные числа.

Возможные форматы исследований включают в себя:

• Иммунофенотипирование цельной крови

• Анализы без лизирования

• анализ РВМС

• Исследование костного мозга

• Анализ клеточной культуры

• Исследования иммунного мониторинга

• Доклинические исследования

• Разработка процесса клеточной терапии

Клеточная культура и мониторинг биопроцессов

Потенциальные исследовательские приложения включают в себя:

• Подсчет культивированных иммунных клеток

• Мониторинг расширения Т-клеток

• Мониторинг культуры NK-клеток

• Исследования восстановления клеток

• Разработка процесса производства клеток

• Исследование жизнеспособности и урожайности клеток

• Отбор проб биопроцессов

Красители для определения жизнеспособности и счетные микросферы можно комбинировать, если флуоресцентная панель обеспечивает достаточное разделение каналов.

Исследования стволовых клеток и клеток-предшественников

Микросферы можно оценивать в ходе исследовательских процессов, включающих:

• Подсчет CD34-положительных клеток

• Исследование гемопоэтических предшественников

• Восстановление обработки клеток

• Исследования криоконсервации

• Разработка процесса клеточной терапии

Требуется проверка конкретного метода.

Подсчет микроорганизмов и частиц

После соответствующей проверки тот же принцип, основанный на соотношении, может быть оценен для:

• Дрожжи

• Бактерии

• Микроводоросли

• Синтетические частицы

• Препараты внеклеточных везикул

• Частицы окружающей среды

Размер частиц, порог рассеяния и разделение флуоресценции должны соответствовать цели.

Разработка приборов и методов

Продукт также может поддерживать:

• Разработка метода проточной цитометрии

• Оптимизация подготовки проб

• Валидация метода пипетирования

• Обучение операторов

• Разработка программного обеспечения

• Исследования точности счета

• Межинструментальное сравнение

• Разработка реагентов для счета OEM

Рекомендуемый рабочий процесс проточной цитометрии

Шаг 1: Подготовьте образец

Подготовьте известный объем биологического образца.

Записывать:

• Исходный объем образца

• Любое предварительное разбавление

• Объем окрашивания

• Объем лизиса

• Конечный коэффициент разбавления

• Любой этап стирки

Потеря клеток во время промывания может повлиять на соотношение между результатом измерения и исходным образцом.

Шаг 2: Окрасьте клетки

Добавьте необходимую панель антител и инкубируйте в соответствии с утвержденным методом.

Защищайте флуоресцентные реагенты от ненужного воздействия света.

Шаг 3. При необходимости лизируйте эритроциты.

Для исследований цельной крови используйте проверенный метод лизиса.

Рабочий процесс без лизирования может уменьшить потерю клеток, но необходимо подтвердить совместимость с суспензией микросфер и панелью антител.

Шаг 4: Смешайте микросферы

Непосредственно перед пипетированием:

• Доведите изделие до необходимой рабочей температуры.

• Смешайте в соответствии с утвержденными инструкциями.

• Убедитесь, что не осталось осевшего слоя.

• Избегайте образования пены.

• Избегайте длительного встряхивания на высокой скорости, если это не подтверждено.

• Проверьте наличие видимых агрегатов.

AccuCheck рекомендует тщательное перемешивание и обратное пипетирование для повышения точности подсчета.

Шаг 5: Отберите точный объем микросфер с помощью пипетки.

Используйте калиброванную пипетку.

Для критической количественной работы рассмотрите:

• Обратное пипетирование

• Советы по низкому удержанию

• Постоянная глубина аспирации

• Постоянная скорость пипетирования

• Дозирование с помощью мокрого наконечника

• Гравиметрическая проверка пипеток

• Повторить исследования по дозированию

Шаг 6. Немедленно получите образец

После добавления микросфер:

• Аккуратно перемешайте.

• Избегайте длительной задержки перед приобретением.

• Храните образец в защищенном от света месте.

• Избегайте ненужного урегулирования.

• Поддерживайте постоянное время приобретения.

Шаг 7: Соберите достаточное количество событий микросферы

Для опытно-конструкторских работ сбор как минимум 1000 событий микросферы является полезной отправной целью на основе рабочего процесса AccuCheck. Окончательное требование к событию должно быть установлено на основе точности, необходимой для конкретного метода.

Низкое количество событий в микросферах может увеличить статистическую неопределенность.

Шаг 8. Примените проверенные ворота

Записывать:

• Всего микросферных событий

• События целевой ячейки

• Исключенные совокупные события

• Время приобретения

• Общий анализируемый объем, если доступен

• Настройки инструмента

Шаг 9: Рассчитайте результат

Используйте концентрацию микросфер для конкретной партии и проверенную формулу.

Не заменяйте числовую концентрацию частиц содержанием твердых веществ 0,5%.

Предлагаемая стратегия шлюзования

Ворота 1: Стабильность времени

Постройте время по одному каналу флуоресценции или общей частоте событий.

Исключить периоды, показывающие:

• Прерванный поток

• Образцы сабо

• Внезапные изменения частоты событий

• Пузырьки воздуха

• осаждение микросфер

• Нестабильность аспирации образца

Ворота 2: Широкие ворота частиц

Используйте FSC и SSC, чтобы включить:

• Клетки-мишени

• Подсчет микросфер

Исключать:

• Электронный шум

• Очень мелкий мусор

• Экстремальные агрегаты

Не устанавливайте порог настолько высоко, чтобы счетные микросферы удалялись.

Ворота 3: Ворота флуоресценции микросфер

Постройте график флуоресценции 530 нм против флуоресценции 670 нм.

Определите утвержденную область двойной флуоресцентной микросферы.

Население микросфер должно демонстрировать последовательную взаимосвязь между двумя сигналами флуоресценции.

Ворота 4: синглетные микросферы

Если доступна геометрия импульса, используйте:

• Площадь в зависимости от высоты

• Площадь против ширины

Исключите агрегаты микросфер и совпадающие события.

Ворота 5: популяция клеток-мишеней

Примените проверенные в лаборатории ворота иммунофенотипирования.

Потенциальные маркеры могут включать в себя:

• CD45

• CD3

• CD4

• CD8

• CD19

• CD16

• CD56

• CD14

• Маркеры жизнеспособности

Этап 6: Заключительный обзор мероприятия

Подтверждать:

• Разделение микросферных ворот

• Адекватное количество событий с шариками

• Стабильный коэффициент флуоресценции шариков

• Ожидаемое распределение клеточной популяции

• Отсутствие значительной нестабильности приобретения

• Действительные элементы управления

Факторы, влияющие на абсолютную точность подсчета

Точность концентрации микросфер

Значение гранул/мл напрямую влияет на результат расчета ячейки.

Ошибка в назначенной концентрации микросфер приводит к пропорциональной ошибке в расчетной концентрации клеток.

Точность пипетирования

В расчете предполагается, что заявленный объем микросфер действительно был добавлен.

К потенциальным источникам ошибок относятся:

• Калибровка пипетки

• Удержание чаевых

• Неполная выдача

• Пузырьки воздуха

• Неправильная глубина аспирации

• осаждение микросфер

• Техника оператора

Компания Thermo Fisher отмечает, что точность подсчета сильно зависит от обращения с образцом и точной подачи объема шариков.

Однородность суспензии

Микросферы могут со временем осаждаться.

Если суспензия неоднородна, разные аликвоты могут содержать разное количество микросфер.

Формирование агрегатов

Агрегаты можно считать:

• Одно событие

• Исключенное событие

• Событие, похожее на клетку

• Аномальное флуоресцентное событие

Поэтому совокупный контроль важен для точного подсчета.

Статистика событий

Точность расчета на основе соотношения зависит от количества зарегистрированных событий в клетках и микросферах.

Очень низкое количество событий увеличивает статистическую изменчивость.

Согласованность стробирования

Изменение микросферы или ячейки ячейки между образцами может изменить расчетный результат.

Автоматизированные или заблокированные шаблоны анализа могут улучшить согласованность после проверки.

Настройки порога

Высокий порог FSC или SSC может удалить мелкие счетные микросферы.

Порог, основанный на флуоресценции, можно рассматривать, если он совместим с полной панелью антител.

Потеря образца

Центрифугирование, аспирация и промывание позволяют удалить клетки или микросферы.

Рассчитанный результат следует интерпретировать в соответствии с рабочим процессом подготовки проб.

Совпадение и высокая частота событий

Чрезмерная частота событий может привести к одновременному прохождению нескольких частиц через точку обнаружения.

При необходимости разбавьте образец или уменьшите скорость потока.

Стабильность инструмента

Изменения в:

• Мощность лазера

• Гидравлика

• Оптическое выравнивание

• Напряжение детектора

• Производительность фильтра

• Скорость потока

может повлиять на идентификацию микросфер и воспроизводимость подсчета.

Руководство по устранению неполадок

Микросферы не видны

Возможные причины:

• Порог слишком высок

• Неправильный канал флуоресценции

• Выбран неправильный лазер

• Напряжение детектора слишком низкое

• Микросферы осели.

• Образец не был перемешан

• Флуоресцентный фильтр несовместим

• Концентрация микросфер слишком низкая

• Изделие подверглось воздействию вредных условий.

Рекомендуемые действия:

1. Уменьшите порог разброса.

2. Проверьте каналы 530 нм и 670 нм.

3. Подтвердите доступность лазера.

4. Тщательно перемешайте суспензию.

5. Запустите микросферы без клеток.

6. Сравните со справочными данными для конкретной партии.

Микросферные ворота слишком широки

Возможные причины:

• Агрегация

• Недостаточное смешивание

• Чрезмерное вортексирование

• Загрязнение

• Насыщение детектора

• Смешанные синглетные и дуплетные соревнования

• Нестабильность прибора

Рекомендуемые действия:

• Примените синглетное стробирование.

• Уменьшите усиление детектора, если он насыщен.

• Осмотрите подвеску.

• Используйте чистые пробирки и фильтрованные буферы.

• Сравните результат с сохраненной эталонной партией.

Зеленый сигнал сильный, но дальний красный сигнал слабый

Возможные причины:

• Красный лазер недоступен или неправильно настроен.

• Напряжение детектора дальнего красного цвета слишком низкое

• Центральная длина волны фильтра не подходит

• Плохое выравнивание красного лазера

• Флуоресценция изменилась во время хранения.

• Выбран неправильный канал анализа.

Дальний красный сигнал сильный, но зеленый сигнал слабый

Возможные причины:

• Синий лазер недоступен или неправильно настроен.

• Напряжение детектора зеленого слишком низкое

• Зеленый канал занят или неправильно компенсирован

• Установлен неправильный фильтр выбросов.

• Сигнал 530 нм находится за пределами шкалы сбора данных.

Количество клеток выше, чем ожидалось

Возможные причины:

• Объем микросфер был недоставлен

• Значение концентрации шариков введено неверно

• Микросферы были исключены из ворот

• Агрегаты были исключены как одно событие

• Неправильный коэффициент разбавления образца

• Ворота ячейки включали обломки или дублеты

Количество клеток ниже ожидаемого

Возможные причины:

• Чрезмерный объем микросфер

• Неправильно высокое значение количества гранул/мл

• Потеря клеток во время стирки

• Клетки-мишени исключены из ворот

• Агрегаты клеток учитываются как отдельные события

• Неправильный исходный объем образца

• Деградация образца

Результаты различаются в зависимости от повторов

Возможные причины:

• осаждение микросфер

• Непоследовательное смешивание

• Вариант пипетирования

• Различные задержки приобретения

• Низкое количество событий

• Движение ворот

• Переменный расход

• Неоднородность выборки

Двойные флюоресцентные бусины в сравнении с другими методами подсчета

Двойные флуоресцентные микросферы особенно полезны, когда пользователям требуется внутренний добавленный счетный стандарт с двумя каналами флуоресцентной идентификации.

Контроль качества серийного производства

Абсолютные счетные микросферы требуют как контроля качества материала, так и метрологического контроля.

Рекомендуемые параметры выпуска включают в себя:

Физические свойства

• Средний размер частиц

• Распределение частиц по размерам

• Коэффициент вариации

• Морфология частиц

• Совокупный процент

• Плотность, когда это необходимо

• Появление

• Производительность редисперсии

Свойства флуоресценции

• Ответ на возбуждение 488 нм

• Интенсивность излучения 530 нм

• Ответ на возбуждение 633 нм

• Интенсивность излучения 670 нм

• Двойной положительный процент

• Зеленая флуоресценция CV

• Дальнекрасная флуоресценция CV

• Отношение интенсивности зеленого к дальнему красному

• Фотостабильность

• Стабильность хранения

Концентрационные свойства

• Содержание твердых веществ

• Анализируемые шарики/мл

• Допуск на количество частиц

• Вариант от бутылки к бутылке

• Точность заполнения

• Однородность выборки

• Стабильность заданной концентрации

Функциональные свойства

• Разделение микросферных ворот

• Восстановление во время проточной цитометрии

• Согласование с референтными образцами

• Линейность по концентрации клеток

• Точность внутри пробега

• Межпроходная точность

• Воспроизводимость оператора

• Совместимость инструментов

Рекомендуемый входной контроль

Производителям реагентов следует рассмотреть возможность тестирования каждой поступающей партии на:

1. Появление

2. Редисперсия

3. Размер частиц

4. Совокупный уровень

5. Зеленая флуоресценция

6. Дальнекрасная флуоресценция

7. Двойной положительный процент

8. Шариков/мл

9. Восстановление проточной цитометрии

10. Сравнение с квалифицированной эталонной партией

Стратегия эталонного лота

Соответствующую эталонную партию следует сохранить для сравнения с будущими партиями.

Новые лоты можно оценить с помощью:

• Тот самый цитометр

• Те же настройки детектора

• Тот же образец

• Та самая пипетка

• Тот же шаблон приобретения

• Тот же метод ворот

• Та же программа расчета

Пакетная документация

Доступные или настроенные документы могут включать:

• Сертификат анализа

• Спецификация продукта

• Паспорт безопасности

• Отчет о размере частиц

• Отчет о флуоресценции

• Отчет о концентрации шариков

• Данные о стабильности

• Данные сравнения партий

• Уведомление об изменении производства

Кастомизация и массовое производство

SHBC поддерживает разработку индивидуальных флуоресцентных микросфер для производителей реагентов для проточной цитометрии.

Возможные варианты настройки включают в себя:

• Размер частиц

• Распределение частиц по размерам

• Интенсивность возбуждения 488 нм

• Интенсивность излучения 530 нм

• Интенсивность возбуждения 633 нм

• Интенсивность излучения 670 нм

• Отношение интенсивности зеленого к дальнему красному

• Содержание твердых веществ

• Шариков/мл

• Подвесной буфер

• Система поверхностно-активных веществ

• Система консервации

• Объем упаковки

• Состав с низким связыванием

• OEM-маркировка

• Упаковка под частной торговой маркой

Поставка развития

Возможна поставка небольших партий:

• Совместимость инструментов

• Развитие ворот

• Оценка панели антител

• Исследования пипетирования

• Оптимизация концентрации

• Проверка стабильности

Опытное производство

Пилотные партии могут поддерживать:

• Передача процесса

• Проверка заполнения

• Проверка метода

• Межинструментальное сравнение

• Оценка упаковки

• Ускоренные исследования стабильности

Массовое производство

Массовое производство может включать в себя:

• Бронирование лота

• Критерии выпуска, специфичные для клиента

• Индивидуальная концентрация

• Индивидуальная упаковка

• Долгосрочное планирование поставок

• OEM и ODM услуги

• Пакетная документация

Хранение и обращение

Рекомендуемые практики включают в себя:

• Хранить при температуре 2–8°C, если иное не указано на этикетке продукта или в сертификате подлинности.

• Защищайте изделие от прямого света.

• Не замораживайте, если не подтверждена стабильность при замораживании-оттаивании.

• Перед применением тщательно перемешайте.

• Избегайте загрязнения суспензии запаса.

• Используйте калиброванные пипетки.

• Используйте чистые пробирки и наконечники с низким содержанием связующих.

• Избегайте длительного воздействия повышенной температуры.

• Закройте флакон сразу после использования.

• Следите за сроком годности конкретной партии.

Коммерческие изделия со счетными бусинами обычно хранят при температуре 2–8°C в защищенном от света месте.

Перед использованием:

1. Осмотрите подвеску.

2. Убедитесь, что осевшие микросферы можно редиспергировать.

3. Смешайте в соответствии с утвержденной процедурой.

4. Избегайте введения пены.

5. Пипетируйте сразу после смешивания.

6. Верните бутылку в рекомендованные условия хранения.

Часто задаваемые вопросы

Что такое абсолютные счетные микросферы с двойным фтором?

Это флуоресцентные эталонные микросферы, предназначенные для абсолютного подсчета клеток методом проточной цитометрии.

Микросферы обеспечивают флуоресцентные реакции вблизи 530 нм и 670 нм при возбуждении примерно 488 нм и 633 нм.

Каково содержание твердых веществ?

Продукт имеет содержание сухих веществ 0,5%.

Это соответствует примерно 5 мг материала микросфер на миллилитр, если выражать массу на объем.

Можно ли использовать 0,5% сухих веществ непосредственно в формуле подсчета?

Нет.

Формула абсолютного подсчета требует концентрации частиц для конкретной партии в гранулах/мл или гранулах/мкл.

Одного содержания твердых веществ недостаточно.

Почему для продукта требуется конкретное значение количества шариков на мл?

Рассчитанная концентрация клеток прямо пропорциональна назначенной концентрации микросфер.

Любая ошибка в количестве шариков/мл приводит к соответствующей ошибке в результате подсчета клеток.

Какие лазеры необходимы?

Номинальные длины волн возбуждения составляют 488 нм и 633 нм.

Также можно оценить проточные цитометры, использующие красный лазер с длиной волны 635 или 640 нм.

Какие каналы флуоресценции используются?

Номинальные каналы излучения составляют примерно 530 нм и 670 нм.

Точные фильтры детектора должны соответствовать реальным спектрам флуоресценции.

Можно ли обнаружить микросферы, используя только один канал?

Потенциально да.

Однако использование обоих каналов флуоресценции может улучшить идентификацию микросфер и достоверность стробирования.

Метод должен быть валидирован с использованием предполагаемой панели антител.

Можно ли использовать микросферы Double-Fluo с антителами, конъюгированными с FITC или APC?

Они могут перекрываться с конъюгатами антител, излучающих зеленый или дальний красный свет.

Перед использованием необходимо оценить совместимость панелей, компенсацию и разделение ворот.

Можно ли использовать микросферы с цельной кровью?

Их можно оценить с помощью цельной крови и методов лизирования без промывки.

Реагент для лизиса, панель антител, объем образца и цитометр должны быть проверены.

Можно ли их использовать с культивируемыми клетками?

Да. Их можно оценить на предмет абсолютного подсчета культивируемых клеток, иммунных клеток и других суспензий частиц.

Сколько событий из бисера необходимо собрать?

Минимум примерно 1000 событий шариков можно использовать в качестве отправной цели при разработке метода.

Окончательное требование должно основываться на требуемой точности и ожидаемой концентрации пробы.

Почему я не вижу микросфер на FSC и SSC?

Порог разброса может быть слишком высоким, или микросферы могут иметь более низкий разброс, чем клетки-мишени.

Осторожно уменьшите порог и используйте каналы флуоресценции для идентификации популяции микросфер.

Почему микросферы оседают?

Микросферы имеют плотность, отличную от плотности суспензионной среды, и могут постепенно оседать при хранении.

Тщательно перемешивайте перед каждой аликвотой.

Можно ли настроить размер частиц?

Размер частиц может быть изменен в соответствии с количеством проекта и техническими требованиями.

Можно ли настроить интенсивность флуоресценции?

Интенсивность зеленого, интенсивность дальнего красного и соотношение между двумя каналами могут обсуждаться для OEM-проектов.

Можно ли настроить содержание твердых веществ?

Да. В зависимости от объема производства и требований проекта могут быть доступны различные содержания твердых веществ.

Возможна ли оптовая поставка?

Да. SHBC поддерживает оценочные количества, пилотные партии, массовое производство, резервирование партий и индивидуальную упаковку.

Это готовый диагностический реагент?

Нет.

Микросферы поставляются для исследовательских целей и разработки реагентов. Они не являются законченным диагностическим продуктом, если они отдельно не проверены и не зарегистрированы клиентом.

Запросить образец или оптовое предложение

SHBC поставляет флуоресцентные микросферы для абсолютного счета для проточной цитометрии с двойной флуоресценцией для подсчета иммунных клеток, исследований иммунофенотипирования, разработки методов проточной цитометрии и серийного производства реагентов.

Чтобы запросить образец, техническую консультацию или оптовое предложение, пожалуйста, предоставьте:

• Предполагаемое применение

• Целевая популяция клеток

• Тип образца

• Модель проточного цитометра

• Доступные длины волн лазера

• Конфигурация фильтра детектора

• Панель антител

• Требуемый размер частиц

• Требуемые шарики/мл

• Требуемое содержание твердых веществ

• Требуемый размер упаковки

• Ожидаемый годовой спрос

• Особые требования к контролю качества

Свяжитесь с SHBC, чтобы оценить микросферы Double-Fluo для вашего проекта по абсолютному подсчету клеток, иммуномониторингу, проточной цитометрии или проекту разработки OEM-реагентов.