5 um Doppelfluo-Mikrosphären 0,5 %

Durchflusszytometrie Absolute Zählung fluoreszierender Mikrosphären

SHBC Flow Cytometry Absolute Counting Fluorescent Microspheres sind dual-fluoreszierende Referenzpartikel, die für die absolute Zellzählung, durchflusszytometrische Immunphänotypisierung, Immunzellanalyse und quantitative Partikelzählungsforschung entwickelt wurden.

Die Double-Fluo-Mikrosphären verfügen über zwei Fluoreszenz-Detektionskanäle:

• Anregung bei etwa 488 nm mit einem Emissionszentrum in der Nähe von 530 nm

• Anregung bei etwa 633 nm mit einem Emissionszentrum in der Nähe von 670 nm

Die Mikrokügelchen werden als wässrige Suspension mit einem Feststoffgehalt von 0,5 % geliefert.

Das Dual-Laser- und Dual-Emissions-Fluoreszenzprofil ermöglicht die Identifizierung der Mikrokügelchen sowohl mit blauen als auch mit roten Laserkanälen auf kompatiblen Durchflusszytometern. Wenn ein bekanntes Volumen an Mikrokügelchen mit einer chargenspezifischen, getesteten Partikelkonzentration zu einem bekannten Probenvolumen hinzugefügt wird, kann die absolute Konzentration von Zellen oder anderen Partikeln aus dem Verhältnis von Probenereignissen zu Mikrokügelchenereignissen berechnet werden.

Dieses Produkt ist für Forschungseinrichtungen, Labore für Durchflusszytometrie, Entwickler von Immunphänotypisierungsreagenzien, Antikörperunternehmen und -hersteller bestimmt, die Entwicklungsproben, Pilotmengen oder die Lieferung fluoreszierender Mikrokügelchen in großen Mengen benötigen.

Produktübersicht

Die Durchflusszytometrie gibt üblicherweise den Prozentsatz der Zellen innerhalb einer ausgewählten Population an. Für viele Forschungsanwendungen ist jedoch auch die tatsächliche Zellzahl pro Mikroliter, Milliliter oder ursprünglichem Probenvolumen erforderlich.

Absolut zählende Mikrokügelchen liefern eine interne Partikelreferenz für diese Berechnung.

Ein bekanntes Volumen an Zählmikrosphären wird direkt zur Zellprobe hinzugefügt. Das Durchflusszytometer zeichnet dann die Zielzellereignisse und Mikrosphärenereignisse während derselben Erfassung auf.

Da die Mikrosphärenkonzentration bekannt ist, kann die Anzahl der Zellen in der Originalprobe aus dem Verhältnis zwischen den beiden Ereignispopulationen berechnet werden.

Double-Fluo-Mikrosphären bieten zwei Fluoreszenzreaktionen zur Identifizierung von Mikrosphären:

• Grüne Fluoreszenz nahe 530 nm bei etwa 488 nm Anregung

• Dunkelrote Fluoreszenz nahe 670 nm bei etwa 633 nm Anregung

Das Dual-Fluoreszenzprofil kann Benutzern helfen:

• Unterscheiden Sie zählende Mikrokügelchen von ungefärbten Zellen

• Trennen Sie Mikrosphären von Zelltrümmern

• Bestätigen Sie die Mikrosphärenidentität in zwei Fluoreszenzkanälen

• Reduzieren Sie die Abhängigkeit allein von Streuparametern

• Erstellen Sie ein kompaktes und reproduzierbares Mikrosphärentor

• Unterstützt Durchflusszytometer, die mit blauen und roten Lasern ausgestattet sind

• Entwickeln Sie maßgeschneiderte Reagenzien für die absolute Zählung

• Verbessern Sie die interne Akquise und Prozesskontrolle

Die Mikrosphären können mit Vollblut, lysiertem Vollblut, mononukleären Zellen des peripheren Blutes, kultivierten Zellen, isolierten Immunzellen und anderen Partikelsuspensionen bewertet werden.

Die Kompatibilität muss mit der vorgesehenen Probenmatrix, dem Antikörper-Panel, dem Zytometer und dem Datenanalyse-Workflow überprüft werden.

Hauptmerkmale von Double-Fluo-Mikrosphären

Doppelte Anregung bei 488 nm und 633 nm

Die Double-Fluo-Mikrosphären sind für die Anregung mit zwei gängigen Durchflusszytometer-Laserlinien konzipiert:

• Ungefähr 488 nm blaue Laseranregung

• Ungefähr 633 nm rote Laseranregung

Die 488-nm-Anregung führt zu einer grünen Fluoreszenzreaktion, die nahe 530 nm nachgewiesen werden kann.

Die Anregung bei 633 nm sorgt für eine tiefrote Fluoreszenzreaktion, die nahe 670 nm nachgewiesen werden kann.

Dieses Dual-Laser-Design unterstützt Durchflusszytometer, die sowohl mit blauen als auch roten Lasermodulen ausgestattet sind, und ermöglicht Reagenzentwicklern die Auswahl eines oder beider Fluoreszenzsignale für die Identifizierung von Mikrokügelchen.

Es können auch Instrumente bewertet werden, die rote Laser mit 635 nm oder 640 nm verwenden. Die endgültige Kompatibilität hängt von der Laserleistung, der Filterkonfiguration, der Detektorempfindlichkeit und dem losspezifischen Fluoreszenzspektrum ab.

Duale Emission bei 530 nm und 670 nm

Die nominellen Fluoreszenzemissionskanäle sind:

• Ungefähr 530 nm nach 488-nm-Anregung

• Ungefähr 670 nm nach 633 nm Anregung

Das 530-nm-Signal liegt im Allgemeinen im Detektionsbereich der grünen Fluoreszenz.

Das 670-nm-Signal liegt im Detektionsbereich der tiefroten Fluoreszenz.

Die beiden Fluoreszenzsignale können je nach Antikörper-Panel und Zytometerkonfiguration einzeln oder zusammen verwendet werden.

Ein Dual-Fluoreszenz-Gate kann eine zusätzliche Methode zur Unterscheidung zählender Mikrokügelchen bieten von:

• Ungefärbte Zellen

• Zellfragmente

• Blutplättchen

• Elektronisches Rauschen

• Autofluoreszierende Ereignisse

• Einkanalige fluoreszierende Partikel

• Unspezifische Probenverunreinigungen

Die genauen Filtermittenwellenlängen und -bandbreiten müssen am vorgesehenen Durchflusszytometer überprüft werden.

Wässrige Suspension mit 0,5 % Feststoffgehalt

Das Produkt wird mit einem Feststoffgehalt von 0,5 % geliefert.

Als Gewicht pro Volumen ausgedrückt entsprechen 0,5 % Feststoffe etwa 5 mg Mikrokügelchen pro Milliliter.

Der Feststoffgehalt ist nützlich für:

• Kontrolle des Herstellungsprozesses

• Formulierungsentwicklung

• Verdünnungsberechnungen

• Massenvergleich von Charge zu Charge

• Maßgeschneiderte Konzentrationsvorbereitung

• Füllprozesskontrolle

Der Feststoffgehalt ist jedoch nicht dasselbe wie die Partikelanzahlkonzentration, die für die absolute Zählung erforderlich ist.

Chargenspezifische Bead-Konzentration

Für eine zuverlässige absolute Zählung ist eine losspezifische, gemessene Partikelanzahlkonzentration erforderlich, die wie folgt angegeben wird:

• Perlen/ml

• Perlen/μL

• Perlen pro empfohlenem Testvolumen

Die Konzentration der Perlenanzahl muss mithilfe einer validierten Partikelzählmethode gemessen und auf dem Produktetikett oder dem Analysezertifikat dokumentiert werden.

Dieser Wert wird bei der Berechnung der absoluten Zellzahl verwendet.

Zu den wichtigen Kontrollen gehören:

• Teilchenzahlkonzentration

• Konzentrationstoleranz

• Füllgenauigkeit

• Konsistenz von Flasche zu Flasche

• Homogenität der Suspension

• Reproduzierbarkeit der Probenahme

• Stabilität während der Lagerung

• Stabilität nach dem Transport

Kommerzielle Produkte mit absoluter Zählung basieren ebenfalls auf kalibrierten oder losspezifischen Mikrokügelchenkonzentrationen und nicht nur auf dem Feststoffgehalt.

Einheitliche Partikelgröße

Die kontrollierte Partikelgröße trägt zur Erzeugung einer kompakten Mikrosphärenpopulation in Vorwärts- und Seitenstreudiagrammen bei.

Eine enge Partikelgrößenverteilung kann Folgendes verbessern:

• Gating-Reproduzierbarkeit

• Ereignisidentifikation

• Übertragung von Instrument zu Instrument

• Konsistenz der Probenahme

• Doublet-Diskriminierung

• Chargenvergleich

• Automatisierte Datenanalyse

Die nominale Partikelgröße und der zulässige Größenbereich sollten in der endgültigen Produktspezifikation angegeben werden.

Gleichmäßige Dual-Fluoreszenzintensität

Eine konsistente Fluoreszenzintensität in beiden Kanälen trägt dazu bei, ein klar getrenntes Mikrosphärentor zu erzeugen.

Zu den empfohlenen Fluoreszenzqualitätsattributen gehören:

• Mittlere Intensität der grünen Fluoreszenz

• Variationskoeffizient der grünen Fluoreszenz

• Mittlere Intensität der tiefroten Fluoreszenz

• Variationskoeffizient der Far-Red-Fluoreszenz

• Prozentsatz der dual-positiven Mikrosphären

• Verhältnis von grüner zu dunkelroter Fluoreszenz

• Fluoreszenzstabilität während der Lagerung

• Erkennbarkeit von Instrument zu Instrument

Die beiden Fluoreszenzsignale sollten ausreichend von den beabsichtigten Zellpopulationen und Antikörperkonjugaten getrennt sein.

Interne Fluoreszenzmarkierung

Die fluoreszierenden Farbstoffe werden in die Struktur der Mikrokügelchen eingebaut und verlassen sich nicht nur auf eine schwache Oberflächenadsorption.

Eine interne Fluoreszenzmarkierung kann helfen:

• Reduzieren Sie den Farbstoffverlust

• Verbessern Sie die Waschbeständigkeit

• Sorgen Sie für eine stabile Außenfläche

• Schützen Sie das fluoreszierende Material

• Verbessern Sie die Lagerstabilität

• Unterstützen Sie die langfristige Reagenzienentwicklung

• Reduzieren Sie die Fluoreszenzschwankungen von Charge zu Charge

Das fertige Produkt sollte dennoch vor längerer Einwirkung von starkem Licht geschützt werden.

Absolutes Zählen auf einer Plattform

Die Mikrosphären und Zielzellen werden während desselben Durchflusszytometrielaufs erfasst.

Dadurch kann der Benutzer die Zellkonzentration berechnen, ohne sich ausschließlich auf ein separates Hämatologie-Analysegerät oder einen externen Partikelzähler verlassen zu müssen.

Die Einzelplattformmethode kann die durch die Übertragung prozentualer Ergebnisse zwischen verschiedenen Instrumenten verursachte Variation reduzieren. Offizielle Zählperlenprodukte von Thermo Fisher und Beckman Coulter verwenden das gleiche verhältnisbasierte Prinzip.

Geeignet für die Reagenzienentwicklung und Massenproduktion

SHBC Double-Fluo Microspheres sind für Kunden geeignet, die mehr als nur ein kleines Forschungspaket benötigen.

Zu den verfügbaren Projektphasen können gehören:

• Erste Mikrosphärenbewertung

• Kompatibilitätstest mit Durchflusszytometern

• Entwicklung der Gating-Methode

• Entwicklung von Absolutwert-Reagenzien

• Antikörper-Panel-Kompatibilitätstest

• Pilotfertigung

• Stabilitätsstudien

• Prozessvalidierung

• Massenproduktion

• Grundstücksreservierung

• OEM- und ODM-Fertigung

Technische Spezifikationen

Die folgenden Informationen sollten vor der offiziellen Veröffentlichung bestätigt und hinzugefügt werden:

• Katalognummer

• Nominelle Partikelgröße

• Partikelgrößentoleranz

• Mikrosphärenmatrix

• Chargenspezifische Perlen/ml

• Toleranz der Partikelanzahlkonzentration

• Aufhängepuffer

• Tensid

• Konservierungsmittel

• Packungsgröße

• Lagertemperatur

• Haltbarkeit

Feststoffgehalt vs. Perlenanzahlkonzentration

Feststoffgehalt und Partikelanzahlkonzentration beschreiben unterschiedliche Produkteigenschaften.

Was bedeutet 0,5 % Feststoffe?

Eine Suspension mit 0,5 % Gewicht pro Volumen enthält ungefähr:

5 mg Mikrokügelchen pro Milliliter

Der Feststoffgehalt beschreibt die Gesamtmasse des Mikrokügelchenmaterials in einem bestimmten Volumen.

Es eignet sich für die Herstellung, Verdünnung und Formulierungskontrolle.

Was bedeutet Perlen/ml?

Beads/mL beschreibt die Anzahl der einzelnen Mikrokügelchen in einem Milliliter.

Dieser Wert hängt ab von:

• Mikrosphärendurchmesser

• Partikeldichte

• Partikelgrößenverteilung

• Feststoffkonzentration

• Aggregatebene

• Methode zur Partikelzählung

Zwei Mikrosphärenprodukte können den gleichen Feststoffgehalt von 0,5 %, aber sehr unterschiedliche Perlen/ml-Werte haben, wenn ihre Partikelgrößen unterschiedlich sind.

Welcher Wert wird für die absolute Zählung verwendet?

Die absolute Zellzahlformel erfordert die kalibrierte Partikelanzahlkonzentration, nicht nur den Feststoffgehalt.

Der COA sollte daher eine losspezifische Konzentration bereitstellen, wie zum Beispiel:

• 8,5 × 10⁵ Perlen/ml

• 1,0 × 10⁶ Perlen/ml

• Eine angegebene Anzahl von Perlen pro empfohlenem Testvolumen

Die obigen Beispiele veranschaulichen lediglich Berichtsformate und stellen keine Produktspezifikationen dar.

Wie absolut zählende Mikrosphären funktionieren

Ein bekanntes Volumen an Double-Fluo-Mikrosphären wird zu einem bekannten Volumen der Probe hinzugefügt.

Während der Erfassung zeichnet das Durchflusszytometer Folgendes auf:

• Die Anzahl der Zielzellenereignisse

• Die Anzahl der Zähl-Mikrosphären-Ereignisse

Da die Anzahl der dem Röhrchen hinzugefügten Mikrokügelchen bekannt ist, kann die ursprüngliche Konzentration der Zielzellen aus dem Ereignisverhältnis berechnet werden.

Ein typischer Prozess umfasst:

1. Bereiten Sie die Zellprobe vor oder färben Sie sie.

2. Bei Bedarf rote Blutkörperchen lysieren.

3. Mischen Sie die Zählmikrosphärensuspension gründlich.

4. Fügen Sie ein genau abgemessenes Volumen an Mikrokügelchen hinzu.

5. Nehmen Sie die Probe auf, ohne Zellen oder Mikrokügelchen zu verlieren.

6. Toren Sie die Zielzellpopulation.

7. Verhindern Sie die Population der Double-Fluo-Mikrosphären.

8. Erfassen Sie die Ereigniszahlen von Zellen und Mikrokügelchen.

9. Berechnen Sie die absolute Zellkonzentration.

10. Wenden Sie den erforderlichen Probenverdünnungsfaktor an.

Formel zur Berechnung der absoluten Zellzahl

Die allgemeine Berechnung lautet:

Absolute Zellkonzentration = Zellereignisse ÷ Perlenereignisse × Perlenkonzentration × Perlenvolumen ÷ Probenvolumen × Verdünnungsfaktor

Wenn das Ergebnis in Zellen pro Mikroliter ausgedrückt wird:

Zellen/μL = (Zellereignisse / Bead-Ereignisse) × Bead-Konzentration in Beads/μL × (Perlenvolumen / Probenvolumen) × Verdünnungsfaktor

Wo:

• Zellereignisse sind Ereignisse innerhalb des validierten Zielzellen-Gates.

• Bead-Ereignisse sind Ereignisse innerhalb des validierten Double-Fluo-Microsphere-Gates.

• Die Perlenkonzentration ist der auf dem Echtheitszertifikat angegebene, chargenspezifische Wert.

• Das Perlenvolumen ist das tatsächliche Volumen der hinzugefügten Perlensuspension.

• Das Probenvolumen ist das ursprüngliche Probenvolumen, das für die Berechnung verwendet wurde.

• Der Verdünnungsfaktor berücksichtigt jede anwendbare Verdünnung.

Vereinfachte Berechnung

Wenn die Volumina der Kügelchen und der Probe gleich sind:

Zellen/μL = Zellereignisse ÷ Bead-Ereignisse × Bead-Konzentration in Beads/μL

Diese vereinfachte Formel ist nur gültig, wenn das Probenvorbereitungsdesign die Annahme unterstützt.

Die Zählperlenmethoden von Thermo Fisher und Beckman Coulter verwenden das gleiche zugrunde liegende Verhältnis zwischen Zielzellereignissen und untersuchten Mikrosphärenereignissen.

Warum Double-Fluo Counting Microspheres verwenden?

Bestätigen Sie die Mikrosphärenidentität in zwei Kanälen

Eine Zählpopulation, die nur anhand der Streuung oder eines Fluoreszenzsignals identifiziert wurde, kann sich mit Probentrümmern oder anderen Fluoreszenzereignissen überschneiden.

Eine duale Fluoreszenzsignatur bietet eine zusätzliche Ebene der Mikrosphärenidentifizierung.

Zu den möglichen Gating-Optionen gehören:

• Allein 530 nm Fluoreszenz

• Allein 670 nm Fluoreszenz

• 530 nm gegenüber 670 nm

• FSC versus 530 nm

• SSC versus 670 nm

• Dual-positives Mikrosphären-Gating

Reduzieren Sie die Abhängigkeit vom Streuen allein

Die Vorwärts- und Seitenstreuung kann variieren mit:

• Zytometer-Modell

• Laserausrichtung

• Detektorspannung

• Beispielmatrix

• Brechungsindex der Teilchen

• Schwellenwerteinstellungen

• Wartung des Instruments

Die fluoreszenzbasierte Identifizierung kann dazu beitragen, die Erkennung von Mikrokügelchen aufrechtzuerhalten, wenn die Streuungstrennung begrenzt ist.

Unterstützt blaue und rote Laserinstrumente

Viele mehrfarbige Durchflusszytometer enthalten sowohl blaue als auch rote Laser.

Double-Fluo-Mikrosphären ermöglichen Herstellern die Entwicklung von Zählreagenzien, die kompatibel sind mit:

• Blaue Lasererkennung

• Rote-Laser-Erkennung

• Dual-Laser-Bestätigung

• Verschiedene Filterkonfigurationen

• Verschiedene Antikörper-Panels

Verbessern Sie die interne Qualitätskontrolle

Wenn eine definierte Dual-Fluoreszenz-Beziehung hergestellt ist, können Benutzer Folgendes überwachen:

• Verlust eines Fluoreszenzsignals

• Falsche Torplatzierung

• Fehler im optischen Kanal

• Probenkontamination

• Mikrosphärenaggregation

• Anormales Signalverhältnis

• Änderungen der Instrumenteneinstellungen

Unterstützen Sie automatisierte Analysen

Eine kompakte, dual-positive Mikrosphärenpopulation kann dazu beitragen, die automatisierte Identifizierung durch Analysesoftware zu vereinfachen.

Automatisiertes Gating sollte weiterhin validiert werden für:

• Mehrere Lose

• Mehrere Instrumente

• Mehrere Betreiber

• Verschiedene Probenmatrizen

• Niedrige und hohe Zellkonzentrationen

Kompatibilität von Durchflusszytometern und Detektoren

Blue-Laser-Kanal

Die nominelle Konfiguration des blauen Lasers ist:

• Anregung: ca. 488 nm

• Emission: ca. 530 nm

Mögliche anfängliche Detektorkonfigurationen umfassen Filter, die in der Nähe des grünen Fluoreszenzbereichs zentriert sind.

Die tatsächliche Filterbandbreite muss entsprechend dem Mikrosphärenspektrum und dem Antikörperpanel ausgewählt werden.

Rot-Laser-Kanal

Die nominale Konfiguration des roten Lasers ist:

• Anregung: ca. 633 nm

• Emission: ca. 670 nm

Instrumente, die rote Laser mit 635 nm oder 640 nm verwenden, sind nach der Überprüfung möglicherweise kompatibel.

Überlegungen zum Antikörper-Panel

Der 530-nm-Kanal kann mit gängigen grün emittierenden Antikörperkonjugaten überlappen.

Der 670-nm-Kanal kann mit fernroten Fluorophoren überlappen.

Bewerten Sie während der Panelentwicklung Folgendes:

• Fluoreszenzüberlappung

• Spektraler Spillover

• Vergütungsanforderungen

• Detektorsättigung

• Helligkeit der Mikrosphäre

• Intensität der Zellmarker

• Verfügbare ungenutzte Kanäle

Das Mikrosphärentor kann mithilfe des Kanals eingerichtet werden, der die beste Trennung von den gefärbten Zellpopulationen bietet.

Konventionelle und spektrale Zytometer

Double-Fluo-Mikrosphären können bewertet werden an:

• Konventionelle filterbasierte Durchflusszytometer

• Spektrale Durchflusszytometer

• Tisch-Durchflusszytometer

• Automatisierte Durchflusszytometrie-Analysegeräte

• Zellanalyseplattformen mit volumetrischer Probenahme

• Forschungszellsortierer

Bei Spektralzytometern sollte die vollständige Fluoreszenzsignatur gemessen und gegebenenfalls in die Referenzbibliothek aufgenommen werden.

Empfohlene Anwendungen

Absolute Immunzellzählung

Die Mikrokügelchen können hinsichtlich der absoluten Anzahl von Folgendem ausgewertet werden:

• Gesamtleukozyten

• T-Zellen

• CD4-positive T-Zellen

• CD8-positive T-Zellen

• B-Zellen

• Natürliche Killerzellen

• Monozyten

• Granulozyten

• Dendritische Zellpopulationen

• Andere gesteuerte Untergruppen von Immunzellen

Die Zielpopulation wird mithilfe des validierten Antikörper-Panels und der Gating-Strategie des Labors definiert.

Durchflusszytometrische Immunphänotypisierung

Double-Fluo-Mikrosphären können zu Immunphänotypisierungs-Workflows hinzugefügt werden, um Zellprozentsätze in absolute Zahlen umzuwandeln.

Mögliche Forschungsformate sind:

• Vollblut-Immunphänotypisierung

• Lyse-no-wash-Assays

• PBMC-Analyse

• Knochenmarkforschung

• Zellkulturanalyse

• Studien zur Immunüberwachung

• Präklinische Forschung

• Entwicklung von Zelltherapieprozessen

Überwachung von Zellkulturen und Bioprozessen

Mögliche Forschungsanwendungen umfassen:

• Zählung kultivierter Immunzellen

• Überwachung der T-Zell-Expansion

• Überwachung der NK-Zellkultur

• Studien zur Zellwiederherstellung

• Entwicklung von Zellherstellungsprozessen

• Zelllebensfähigkeits- und Ertragsforschung

• Probenahme von Bioprozessen

Lebensfähigkeitsfarbstoffe und Zählmikrosphären können kombiniert werden, wenn das Fluoreszenzpanel eine ausreichende Kanaltrennung bietet.

Stamm- und Vorläuferzellforschung

Die Mikrosphären können in Forschungsabläufen bewertet werden, die Folgendes umfassen:

• CD34-positive Zellzählung

• Hämatopoetische Vorläuferforschung

• Wiederherstellung der Zellverarbeitung

• Studien zur Kryokonservierung

• Entwicklung von Zelltherapieprozessen

Eine methodenspezifische Validierung ist erforderlich.

Zählung von Mikroorganismen und Partikeln

Nach entsprechender Validierung kann das gleiche verhältnisbasierte Prinzip für Folgendes bewertet werden:

• Hefe

• Bakterien

• Mikroalgen

• Synthetische Partikel

• Extrazelluläre Vesikelpräparate

• Umweltpartikel

Partikelgröße, Streuschwelle und Fluoreszenztrennung müssen für das Ziel geeignet sein.

Instrumenten- und Methodenentwicklung

Das Produkt unterstützt möglicherweise auch Folgendes:

• Entwicklung der Durchflusszytometer-Methode

• Optimierung der Probenvorbereitung

• Validierung der Pipettiermethode

• Bedienerschulung

• Software-Gating-Entwicklung

• Zählpräzisionsstudien

• Vergleich zwischen Instrumenten

• Entwicklung von OEM-Zählreagenzien

Empfohlener Durchflusszytometrie-Workflow

Schritt 1: Bereiten Sie die Probe vor

Bereiten Sie ein bekanntes Volumen der biologischen Probe vor.

Aufzeichnen:

• Originales Probenvolumen

• Irgendeine Vorverdünnung

• Färbevolumen

• Lysevolumen

• Endgültiger Verdünnungsfaktor

• Jeder Waschschritt

Der Verlust von Zellen beim Waschen kann den Zusammenhang zwischen dem Messergebnis und der Originalprobe beeinträchtigen.

Schritt 2: Färben Sie die Zellen

Fügen Sie das erforderliche Antikörper-Panel hinzu und inkubieren Sie es gemäß der validierten Methode.

Schützen Sie fluoreszierende Reagenzien vor unnötiger Lichteinwirkung.

Schritt 3: Lyse der roten Blutkörperchen, falls erforderlich

Verwenden Sie für Vollblutanwendungen eine validierte Lysemethode.

Ein Lyse-No-Wash-Arbeitsablauf kann den Zellverlust reduzieren, die Kompatibilität mit der Mikrosphärensuspension und dem Antikörper-Panel muss jedoch bestätigt werden.

Schritt 4: Mischen Sie die Mikrosphären

Unmittelbar vor dem Pipettieren:

• Bringen Sie das Produkt auf die erforderliche Betriebstemperatur.

• Gemäß den validierten Anweisungen mischen.

• Stellen Sie sicher, dass keine abgesetzte Schicht zurückbleibt.

• Schaumbildung vermeiden.

• Vermeiden Sie längeres Vortexen mit hoher Geschwindigkeit, sofern dies nicht validiert ist.

• Auf sichtbare Aggregate prüfen.

AccuCheck empfiehlt sorgfältiges Mischen und umgekehrtes Pipettieren, um die Zählgenauigkeit zu verbessern.

Schritt 5: Pipettieren Sie ein genaues Mikrosphärenvolumen

Verwenden Sie eine kalibrierte Pipette.

Berücksichtigen Sie für kritische quantitative Arbeiten Folgendes:

• Rückwärtspipettieren

• Tipps zur geringen Retention

• Konsistente Anspruchstiefe

• Gleichbleibende Pipettiergeschwindigkeit

• Abgabe mit nasser Spitze

• Gravimetrische Pipettenverifizierung

• Replizieren Sie Abgabestudien

Schritt 6: Besorgen Sie sich umgehend die Probe

Nach Zugabe der Mikrokügelchen:

• Vorsichtig mischen.

• Vermeiden Sie längere Verzögerungen vor der Akquise.

• Bewahren Sie die Probe vor Licht geschützt auf.

• Vermeiden Sie unnötiges Absetzen.

• Sorgen Sie für ein konsistentes Akquise-Timing.

Schritt 7: Sammeln Sie ausreichend Mikrosphärenereignisse

Für die Entwicklungsarbeit ist das Sammeln von mindestens 1.000 Mikrosphärenereignissen ein sinnvolles Ausgangsziel, basierend auf dem AccuCheck-Workflow. Die endgültige Ereignisanforderung sollte anhand der für die spezifische Methode erforderlichen Präzision ermittelt werden.

Niedrige Mikrosphären-Ereigniszahlen können die statistische Unsicherheit erhöhen.

Schritt 8: Wenden Sie die validierten Gates an

Aufzeichnen:

• Gesamtzahl der Mikrosphärenereignisse

• Zielzellenereignisse

• Ausgeschlossene aggregierte Ereignisse

• Erfassungszeit

• Gesamtes analysiertes Volumen, sofern verfügbar

• Instrumenteneinstellungen

Schritt 9: Berechnen Sie das Ergebnis

Verwenden Sie die chargenspezifische Mikrosphärenkonzentration und die validierte Formel.

Ersetzen Sie die Partikelanzahlkonzentration nicht durch den Feststoffgehalt von 0,5 %.

Empfohlene Gating-Strategie

Tor 1: Zeitstabilität

Tragen Sie die Zeit gegen einen Fluoreszenzkanal oder die Gesamtereignisrate auf.

Zeiträume ausschließen, in denen Folgendes angezeigt wird:

• Unterbrochener Fluss

• Beispiel für Clogs

• Plötzliche Änderungen der Ereignisrate

• Luftblasen

• Absetzen der Mikrokügelchen

• Probenaspirationsinstabilität

Tor 2: Breites Partikeltor

Verwenden Sie FSC und SSC, um Folgendes einzubeziehen:

• Zielzellen

• Mikrosphären zählen

Ausschließen:

• Elektronisches Rauschen

• Sehr kleine Trümmer

• Extreme Aggregate

Stellen Sie den Schwellenwert nicht so hoch ein, dass die zählenden Mikrokügelchen entfernt werden.

Tor 3: Mikrosphären-Fluoreszenztor

Zeichnen Sie die 530-nm-Fluoreszenz gegen die 670-nm-Fluoreszenz auf.

Definieren Sie die validierte Double-Fluo-Mikrosphärenregion.

Die Mikrosphärenpopulation sollte eine konsistente Beziehung zwischen den beiden Fluoreszenzsignalen aufweisen.

Tor 4: Singulett-Mikrosphären

Wenn Impulsgeometrie verfügbar ist, verwenden Sie:

• Fläche versus Höhe

• Fläche versus Breite

Mikrosphärenaggregate und zusammenfallende Ereignisse ausschließen.

Tor 5: Zielzellpopulation

Wenden Sie die validierten Immunphänotypisierungstore des Labors an.

Mögliche Marker können sein:

• CD45

• CD3

• CD4

• CD8

• CD19

• CD16

• CD56

• CD14

• Lebensfähigkeitsmarker

Gate 6: Abschlussrückblick auf die Veranstaltung

Bestätigen:

• Mikrosphären-Gate-Trennung

• Ausreichende Anzahl von Perlenereignissen

• Stabiles Perlenfluoreszenzverhältnis

• Erwartete Zellpopulationsverteilung

• Keine größere Akquisitionsinstabilität

• Gültige Kontrollen

Faktoren, die die absolute Zählgenauigkeit beeinflussen

Genauigkeit der Mikrosphärenkonzentration

Der Wert „Perlen/ml“ wirkt sich direkt auf das berechnete Zellergebnis aus.

Ein Fehler in der zugewiesenen Mikrosphärenkonzentration führt zu einem proportionalen Fehler in der berechneten Zellkonzentration.

Pipettiergenauigkeit

Bei der Berechnung wird davon ausgegangen, dass tatsächlich die angegebene Menge an Mikrosphären hinzugefügt wurde.

Mögliche Fehlerquellen sind:

• Pipettenkalibrierung

• Spitzenretention

• Unvollständige Abgabe

• Luftblasen

• Falsche Aspirationstiefe

• Absetzen der Mikrokügelchen

• Bedienertechnik

Thermo Fisher weist darauf hin, dass die Zählgenauigkeit stark von der Probenhandhabung und der präzisen Bereitstellung des Perlenvolumens abhängt.

Homogenität der Suspension

Mit der Zeit können sich Mikrokügelchen absetzen.

Wenn die Suspension nicht homogen ist, können verschiedene Aliquots eine unterschiedliche Anzahl an Mikrokügelchen enthalten.

Aggregatbildung

Aggregate können gezählt werden als:

• Eine Veranstaltung

• Ein ausgeschlossenes Ereignis

• Ein zellenartiges Ereignis

• Ein abnormales Fluoreszenzereignis

Für eine genaue Zählung ist daher eine Aggregatkontrolle wichtig.

Ereignisstatistik

Die Genauigkeit einer verhältnisbasierten Berechnung hängt von der Anzahl der aufgezeichneten Zell- und Mikrosphärenereignisse ab.

Sehr niedrige Ereigniszahlen erhöhen die statistische Variation.

Gating-Konsistenz

Das Ändern der Mikrosphäre oder des Zelltors zwischen Proben kann das berechnete Ergebnis verändern.

Automatisierte oder gesperrte Analysevorlagen können die Konsistenz nach der Validierung verbessern.

Schwellenwerteinstellungen

Ein hoher FSC- oder SSC-Schwellenwert kann kleine Mikrokügelchen entfernen.

Ein fluoreszenzbasierter Schwellenwert kann in Betracht gezogen werden, wenn er mit dem vollständigen Antikörperpanel kompatibel ist.

Probenverlust

Durch Zentrifugieren, Absaugen und Waschen können Zellen oder Mikrosphären entfernt werden.

Das berechnete Ergebnis muss entsprechend dem Probenvorbereitungs-Workflow interpretiert werden.

Zufall und hohe Ereignisrate

Zu hohe Ereignisraten können dazu führen, dass mehrere Partikel gleichzeitig den Detektionspunkt passieren.

Verdünnen Sie die Probe oder reduzieren Sie die Flussrate bei Bedarf.

Instrumentenstabilität

Änderungen in:

• Laserleistung

• Fluidik

• Optische Ausrichtung

• Detektorspannung

• Filterleistung

• Durchflussrate

kann die Identifizierung von Mikrokügelchen und die Reproduzierbarkeit der Zählung beeinträchtigen.

Leitfaden zur Fehlerbehebung

Mikrosphären sind nicht sichtbar

Mögliche Ursachen:

• Der Schwellenwert ist zu hoch

• Falscher Fluoreszenzkanal

• Falscher Laser ausgewählt

• Die Detektorspannung ist zu niedrig

• Mikrokügelchen haben sich abgesetzt

• Probe wurde nicht gemischt

• Fluoreszenzfilter ist nicht kompatibel

• Die Mikrosphärenkonzentration ist zu niedrig

• Das Produkt war schädigenden Bedingungen ausgesetzt

Empfohlene Maßnahmen:

1. Reduzieren Sie die Streuschwelle.

2. Überprüfen Sie die 530-nm- und 670-nm-Kanäle.

3. Bestätigen Sie die Verfügbarkeit des Lasers.

4. Mischen Sie die Suspension gründlich.

5. Führen Sie Mikrosphären ohne Zellen aus.

6. Vergleichen Sie mit den losspezifischen Referenzdaten.

Das Mikrosphärentor ist zu breit

Mögliche Ursachen:

• Aggregation

• Unzureichende Mischung

• Übermäßiges Wirbeln

• Kontamination

• Detektorsättigung

• Gemischte Singlet- und Doublet-Events

• Instabilität des Instruments

Empfohlene Maßnahmen:

• Wenden Sie das Singlet-Gating an.

• Reduzieren Sie die Detektorverstärkung bei Sättigung.

• Überprüfen Sie die Aufhängung.

• Verwenden Sie saubere Röhrchen und gefilterte Puffer.

• Vergleichen Sie das Ergebnis mit einer zurückbehaltenen Referenzcharge.

Das grüne Signal ist stark, aber das dunkelrote Signal ist schwach

Mögliche Ursachen:

• Der rote Laser ist nicht verfügbar oder falsch konfiguriert

• Die Spannung des Dunkelrot-Detektors ist zu niedrig

• Die mittlere Wellenlänge des Filters ist ungeeignet

• Die Ausrichtung des roten Lasers ist schlecht

• Die Fluoreszenz hat sich während der Lagerung verändert

• Es wurde der falsche Analysekanal ausgewählt

Das dunkelrote Signal ist stark, aber das grüne Signal ist schwach

Mögliche Ursachen:

• Blauer Laser ist nicht verfügbar oder falsch konfiguriert

• Die Spannung des grünen Detektors ist zu niedrig

• Grüner Kanal ist belegt oder falsch kompensiert

• Es ist ein falscher Emissionsfilter installiert

• Das 530-nm-Signal liegt außerhalb des Erfassungsmaßstabs

Die Zellzahl ist höher als erwartet

Mögliche Ursachen:

• Das Mikrosphärenvolumen wurde nicht ausreichend abgegeben

• Der Wert für die Perlenkonzentration wurde falsch eingegeben

• Mikrosphären wurden vom Gate ausgeschlossen

• Aggregate wurden als ein Ereignis ausgeschlossen

• Der Probenverdünnungsfaktor war falsch

• Das Zelltor enthielt Trümmer oder Dubletts

Die Zellzahl ist niedriger als erwartet

Mögliche Ursachen:

• Zu großes Mikrosphärenvolumen

• Falsch hoher Wert für Perlen/ml

• Zellverlust beim Waschen

• Vom Gate ausgeschlossene Zielzellen

• Zellaggregate werden als Einzelereignisse gezählt

• Falsches ursprüngliches Probenvolumen

• Probenverschlechterung

Die Ergebnisse variieren zwischen den Replikaten

Mögliche Ursachen:

• Absetzen der Mikrokügelchen

• Inkonsistente Mischung

• Pipettiervariante

• Unterschiedliche Erfassungsverzögerungen

• Niedrige Ereignisanzahl

• Torbewegung

• Variable Durchflussmenge

• Probenheterogenität

Double-Fluo-Perlen im Vergleich zu anderen Zählmethoden

Double-Fluo-Mikrosphären sind besonders nützlich, wenn Benutzer einen intern hinzugefügten Zählstandard mit zwei Kanälen zur Fluoreszenzidentifizierung benötigen.

Qualitätskontrolle für die Serienproduktion

Absolut zählende Mikrokügelchen erfordern sowohl eine Materialqualitätskontrolle als auch eine messtechnische Kontrolle.

Zu den empfohlenen Freigabeparametern gehören:

Physikalische Eigenschaften

• Mittlere Partikelgröße

• Partikelgrößenverteilung

• Variationskoeffizient

• Partikelmorphologie

• Gesamtprozentsatz

• Dichte, sofern relevant

• Aussehen

• Redispergierleistung

Fluoreszenzeigenschaften

• Anregungsreaktion bei 488 nm

• Emissionsintensität 530 nm

• Anregungsreaktion bei 633 nm

• Emissionsintensität 670 nm

• Doppelt positiver Prozentsatz

• Grüner Fluoreszenz-CV

• Dunkelroter Fluoreszenz-CV

• Intensitätsverhältnis von Grün zu Dunkelrot

• Photostabilität

• Lagerstabilität

Konzentrationseigenschaften

• Feststoffgehalt

• Getestete Perlen/ml

• Partikelzahltoleranz

• Variante von Flasche zu Flasche

• Genauigkeit des Füllvolumens

• Homogenität der Probenahme

• Stabilität der zugewiesenen Konzentration

Funktionelle Eigenschaften

• Mikrosphären-Gate-Trennung

• Erholung während der Durchflusszytometrie

• Übereinstimmung mit Referenzzählproben

• Linearität über Zellkonzentrationen hinweg

• Präzision innerhalb des Laufs

• Präzision zwischen den Läufen

• Reproduzierbarkeit durch den Bediener

• Instrumentenkompatibilität

Empfohlene Eingangskontrolle

Reagenzhersteller sollten erwägen, jede eingehende Charge auf Folgendes zu testen:

1. Aussehen

2. Redispergierung

3. Partikelgröße

4. Aggregatebene

5. Grüne Fluoreszenz

6. Dunkelrote Fluoreszenz

7. Doppelt positiver Prozentsatz

8. Perlen/ml

9. Wiederherstellung der Durchflusszytometrie

10. Vergleich mit einer qualifizierten Referenzcharge

Referenz-Lot-Strategie

Zum Vergleich mit zukünftigen Chargen sollte eine qualifizierte Referenzcharge aufbewahrt werden.

Neue Lose können bewertet werden mit:

• Das gleiche Zytometer

• Die gleichen Detektoreinstellungen

• Die gleiche Probe

• Die gleiche Pipette

• Dieselbe Akquisitionsvorlage

• Die gleiche Gating-Methode

• Die gleiche Berechnungssoftware

Chargendokumentation

Zu den verfügbaren oder angepassten Dokumenten können gehören:

• Analysezertifikat

• Produktspezifikation

• Sicherheitsdatenblatt

• Bericht zur Partikelgröße

• Fluoreszenzbericht

• Bericht zur Perlenkonzentration

• Stabilitätsdaten

• Chargenvergleichsdaten

• Benachrichtigung über Fertigungsänderungen

Individualisierung und Massenfertigung

SHBC unterstützt die Entwicklung maßgeschneiderter fluoreszierender Mikrokügelchen für Hersteller von Durchflusszytometrie-Reagenzien.

Zu den möglichen Anpassungsoptionen gehören:

• Partikelgröße

• Partikelgrößenverteilung

• 488 nm Anregungsintensität

• Emissionsintensität 530 nm

• 633 nm Anregungsintensität

• Emissionsintensität 670 nm

• Intensitätsverhältnis von Grün zu Dunkelrot

• Feststoffgehalt

• Perlen/ml

• Aufhängepuffer

• Tensidsystem

• Konservierungssystem

• Paketvolumen

• Niedrig bindende Formulierung

• OEM-Kennzeichnung

• Private-Label-Verpackung

Entwicklungsversorgung

Kleinere Mengen sind lieferbar für:

• Instrumentenkompatibilität

• Gating-Entwicklung

• Antikörper-Panel-Bewertung

• Pipettierstudien

• Konzentrationsoptimierung

• Stabilitätsprüfung

Pilotproduktion

Pilotlose können Folgendes unterstützen:

• Prozessübertragung

• Füllvalidierung

• Methodenvalidierung

• Vergleich zwischen Instrumenten

• Verpackungsbewertung

• Beschleunigte Stabilitätsstudien

Massenfertigung

Die Massenproduktion kann Folgendes umfassen:

• Grundstücksreservierung

• Kundenspezifische Freigabekriterien

• Maßgeschneiderte Konzentration

• Maßgeschneiderte Verpackung

• Langfristige Versorgungsplanung

• OEM- und ODM-Dienstleistungen

• Chargendokumentation

Lagerung und Handhabung

Zu den empfohlenen Vorgehensweisen gehören:

• Bei 2–8 °C lagern, sofern auf dem Produktetikett oder dem Echtheitszertifikat nichts anderes angegeben ist.

• Schützen Sie das Produkt vor direktem Licht.

• Nicht einfrieren, es sei denn, die Gefrier-Tau-Stabilität wurde bestätigt.

• Vor Gebrauch gründlich mischen.

• Vermeiden Sie eine Kontamination der Stoffsuspension.

• Verwenden Sie kalibrierte Pipetten.

• Verwenden Sie saubere Röhrchen und Spitzen mit geringer Bindung.

• Vermeiden Sie eine längere Einwirkung erhöhter Temperaturen.

• Verschließen Sie die Flasche sofort nach Gebrauch.

• Beachten Sie das chargenspezifische Verfallsdatum.

Handelsübliche Zählperlenprodukte werden üblicherweise bei 2–8 °C und vor Licht geschützt gelagert.

Vor dem Gebrauch:

1. Überprüfen Sie die Aufhängung.

2. Bestätigen Sie, dass abgesetzte Mikrokügelchen redispergiert werden können.

3. Nach dem validierten Verfahren mischen.

4. Schaumeintrag vermeiden.

5. Sofort nach dem Mischen pipettieren.

6. Bringen Sie die Flasche wieder in den empfohlenen Lagerzustand.

Häufig gestellte Fragen

Was sind absolut zählende Double-Fluo-Mikrosphären?

Es handelt sich um fluoreszierende Referenzmikrosphären, die für die absolute Zellzählung mittels Durchflusszytometrie konzipiert sind.

Die Mikrokügelchen liefern Fluoreszenzreaktionen nahe 530 nm und 670 nm bei etwa 488 nm und 633 nm Anregung.

Wie hoch ist der Feststoffgehalt?

Das Produkt hat einen Feststoffgehalt von 0,5 %.

Dies entspricht etwa 5 mg Mikrokügelchenmaterial pro Milliliter, ausgedrückt als Gewicht pro Volumen.

Können 0,5 % Feststoffe direkt in der Zählformel verwendet werden?

NEIN.

Die absolute Zählformel erfordert die chargenspezifische Partikelanzahlkonzentration in Perlen/ml oder Perlen/μL.

Der Feststoffgehalt allein reicht nicht aus.

Warum benötigt das Produkt einen chargenspezifischen Wert für Perlen/ml?

Die berechnete Zellkonzentration ist direkt proportional zur zugewiesenen Mikrosphärenkonzentration.

Jeder Fehler bei den Perlen/ml führt zu einem entsprechenden Fehler im Zellzählergebnis.

Welche Laser werden benötigt?

Die nominellen Anregungswellenlängen betragen 488 nm und 633 nm.

Auch Durchflusszytometer mit einem 635-nm- oder 640-nm-Rotlaser können ausgewertet werden.

Welche Fluoreszenzkanäle werden verwendet?

Die nominalen Emissionskanäle betragen etwa 530 nm und 670 nm.

Die genauen Detektorfilter müssen auf die tatsächlichen Fluoreszenzspektren abgestimmt sein.

Können die Mikrosphären nur über einen Kanal detektiert werden?

Möglicherweise ja.

Die Verwendung beider Fluoreszenzkanäle kann jedoch die Mikrosphärenidentifizierung und das Gating-Vertrauen verbessern.

Die Methode sollte mit dem vorgesehenen Antikörperpanel validiert werden.

Können Double-Fluo-Mikrosphären mit FITC- oder APC-konjugierten Antikörpern verwendet werden?

Sie können mit grün oder dunkelrot emittierenden Antikörperkonjugaten überlappen.

Panelkompatibilität, Kompensation und Gate-Trennung müssen vor der Verwendung bewertet werden.

Können die Mikrosphären mit Vollblut verwendet werden?

Sie können mit Vollblut- und Lyse-No-Wash-Arbeitsabläufen bewertet werden.

Das Lysereagenz, das Antikörper-Panel, das Probenvolumen und das Zytometer müssen validiert werden.

Können sie mit kultivierten Zellen verwendet werden?

Ja. Sie können zur absoluten Zählung kultivierter Zellen, Immunzellen und anderer Partikelsuspensionen ausgewertet werden.

Wie viele Perlenereignisse sollten gesammelt werden?

Als Ausgangsziel für die Methodenentwicklung können mindestens etwa 1.000 Bead-Ereignisse verwendet werden.

Die endgültige Anforderung sollte auf der erforderlichen Präzision und der erwarteten Probenkonzentration basieren.

Warum kann ich die Mikrosphären auf FSC und SSC nicht sehen?

Der Streuschwellenwert ist möglicherweise zu hoch oder die Mikrokügelchen weisen möglicherweise eine geringere Streuung auf als die Zielzellen.

Reduzieren Sie den Schwellenwert vorsichtig und verwenden Sie die Fluoreszenzkanäle, um die Mikrosphärenpopulation zu identifizieren.

Warum setzen sich die Mikrokügelchen ab?

Mikrokügelchen haben eine andere Dichte als das Suspensionsmedium und können sich während der Lagerung allmählich absetzen.

Vor jedem Aliquot gründlich mischen.

Kann die Partikelgröße individuell angepasst werden?

Eine individuelle Anpassung der Partikelgröße kann je nach Projektmenge und technischen Anforderungen möglich sein.

Kann die Fluoreszenzintensität individuell angepasst werden?

Für OEM-Projekte können die Grünintensität, die Dunkelrotintensität und das Verhältnis zwischen den beiden Kanälen diskutiert werden.

Kann der Feststoffgehalt individuell angepasst werden?

Ja. Je nach Produktionsmenge und Projektanforderungen können unterschiedliche Feststoffgehalte verfügbar sein.

Ist eine Großlieferung verfügbar?

Ja. SHBC unterstützt Evaluierungsmengen, Pilotchargen, Massenfertigung, Chargenreservierung und kundenspezifische Verpackungen.

Handelt es sich um ein fertiges Diagnosereagenz?

NEIN.

Die Mikrosphären werden für Forschungszwecke und die Reagenzentwicklung bereitgestellt. Sie sind kein fertiges Diagnoseprodukt, es sei denn, sie werden vom Kunden separat validiert und registriert.

Fordern Sie ein Muster- oder Massenangebot an

SHBC liefert Double-Fluo-Durchflusszytometrie-Absolutzählungs-Fluoreszenz-Mikrosphären für die Immunzellenzählung, die Immunphänotypisierungsforschung, die Entwicklung von Durchflusszytometermethoden und die Herstellung von Chargenreagenzien.

Um ein Muster, eine technische Beratung oder ein Sammelangebot anzufordern, geben Sie bitte Folgendes an:

• Verwendungszweck

• Zielzellpopulation

• Probentyp

• Durchflusszytometer-Modell

• Verfügbare Laserwellenlängen

• Konfiguration des Detektorfilters

• Antikörper-Panel

• Erforderliche Partikelgröße

• Erforderliche Perlen/ml

• Erforderlicher Feststoffgehalt

• Erforderliche Paketgröße

• Erwarteter Jahresbedarf

• Besondere Anforderungen an die Qualitätskontrolle

Kontaktieren Sie SHBC, um Double-Fluo-Mikrosphären für Ihr Projekt zur absoluten Zellzählung, Immunüberwachung, Durchflusszytometrie oder OEM-Reagenzienentwicklung zu evaluieren.