Microesferas Fluo Doble 5um 0,5%

Microesferas fluorescentes de conteo absoluto de citometría de flujo

Las microesferas fluorescentes de conteo absoluto de citometría de flujo SHBC son partículas de referencia fluorescentes duales desarrolladas para la enumeración celular absoluta, inmunofenotipado por citometría de flujo, análisis de células inmunitarias e investigación cuantitativa de recuento de partículas.

Las Microesferas Double-Fluo cuentan con dos canales de detección de fluorescencia:

• Excitación a aproximadamente 488 nm con emisión centrada cerca de 530 nm

• Excitación a aproximadamente 633 nm con emisión centrada cerca de 670 nm

Las microesferas se suministran como una suspensión acuosa con un contenido de sólidos del 0,5%.

El perfil de fluorescencia de doble láser y doble emisión permite identificar las microesferas utilizando canales de láser azul y rojo en citómetros de flujo compatibles. Cuando se añade un volumen conocido de microesferas con una concentración de partículas analizada específica del lote a un volumen de muestra conocido, la concentración absoluta de células u otras partículas se puede calcular a partir de la relación entre los eventos de la muestra y los eventos de las microesferas.

Este producto está destinado a instituciones de investigación, laboratorios de citometría de flujo, desarrolladores de reactivos de inmunofenotipado, empresas de anticuerpos y fabricantes que requieren muestras de desarrollo, cantidades piloto o suministro de microesferas fluorescentes a granel.

Descripción general del producto

La citometría de flujo comúnmente informa el porcentaje de células dentro de una población seleccionada. Sin embargo, muchas aplicaciones de investigación también requieren la cantidad real de células por microlitro, mililitro o volumen de muestra original.

Las microesferas de conteo absoluto proporcionan una referencia de partículas internas para este cálculo.

Se añade un volumen conocido de microesferas de recuento directamente a la muestra de células. Luego, el citómetro de flujo registra los eventos de la célula objetivo y los eventos de las microesferas durante la misma adquisición.

Como se conoce la concentración de microesferas, el número de células en la muestra original se puede calcular a partir de la relación entre las dos poblaciones de eventos.

Las microesferas Double-Fluo proporcionan dos respuestas de fluorescencia para la identificación de microesferas:

• Fluorescencia verde cerca de 530 nm bajo una excitación de aproximadamente 488 nm

• Fluorescencia de color rojo lejano cerca de 670 nm con una excitación de aproximadamente 633 nm

El perfil fluorescente dual puede ayudar a los usuarios a:

• Distinguir microesferas de recuento de células no teñidas

• Separar las microesferas de los desechos celulares.

• Confirmar la identidad de las microesferas en dos canales de fluorescencia.

• Reducir la dependencia únicamente de los parámetros de dispersión

• Establecer una puerta de microesferas compacta y reproducible.

• Citómetros de flujo de soporte equipados con láseres azules y rojos

• Desarrollar reactivos de conteo absoluto personalizados

• Mejorar la adquisición interna y el control de procesos.

Las microesferas pueden evaluarse con sangre entera, sangre entera lisada, células mononucleares de sangre periférica, células cultivadas, células inmunitarias aisladas y otras suspensiones de partículas.

Se debe verificar la compatibilidad con la matriz de muestra, el panel de anticuerpos, el citómetro y el flujo de trabajo de análisis de datos previstos.

Características clave de las microesferas de doble fluo

Excitación dual a 488 nm y 633 nm

Las microesferas Double-Fluo están diseñadas para la excitación utilizando dos líneas láser de citómetro de flujo comunes:

• Excitación de láser azul de aproximadamente 488 nm

• Excitación de láser rojo de aproximadamente 633 nm

La excitación de 488 nm proporciona una respuesta fluorescente verde que puede detectarse cerca de 530 nm.

La excitación de 633 nm proporciona una respuesta fluorescente de color rojo lejano que puede detectarse cerca de 670 nm.

Este diseño de láser dual admite citómetros de flujo equipados con módulos láser azul y rojo y permite a los desarrolladores de reactivos seleccionar una o ambas señales de fluorescencia para la identificación de microesferas.

También se pueden evaluar instrumentos que utilizan láseres rojos de 635 nm o 640 nm. La compatibilidad final depende de la potencia del láser, la configuración del filtro, la sensibilidad del detector y el espectro de fluorescencia específico del lote.

Emisión dual a 530 nm y 670 nm

Los canales nominales de emisión de fluorescencia son:

• Aproximadamente 530 nm después de una excitación de 488 nm

• Aproximadamente 670 nm después de una excitación de 633 nm

La señal de 530 nm generalmente se encuentra en la región de detección de fluorescencia verde.

La señal de 670 nm se encuentra en la región de detección de fluorescencia del rojo lejano.

Las dos señales de fluorescencia se pueden usar individualmente o juntas según el panel de anticuerpos y la configuración del citómetro.

Una puerta de fluorescencia dual puede proporcionar un método adicional para distinguir las microesferas de recuento de:

• Células sin teñir

• Fragmentos de células

• Plaquetas

• Ruido electrónico

• Eventos autofluorescentes

• Partículas fluorescentes monocanal.

• Contaminantes de muestra inespecíficos

Las longitudes de onda y los anchos de banda exactos del centro del filtro deben verificarse en el citómetro de flujo previsto.

Suspensión acuosa al 0,5% de sólidos

El producto se suministra con un contenido de sólidos del 0,5%.

Cuando se expresa como peso por volumen, 0,5% de sólidos corresponde aproximadamente a 5 mg de microesferas por mililitro.

El contenido de sólidos es útil para:

• Control del proceso de fabricación

• Desarrollo de formulaciones

• Cálculos de dilución

• Comparación masiva de lote a lote

• Preparación de concentración personalizada

• Control del proceso de llenado

Sin embargo, el contenido de sólidos no es lo mismo que la concentración del número de partículas requerida para el conteo absoluto.

Concentración de perlas específicas del lote

Un conteo absoluto confiable requiere una concentración del número de partículas analizadas, específica del lote, expresada como:

• Perlas/mL

• Perlas/μL

• Perlas por volumen de prueba recomendado

La concentración del número de cuentas debe medirse utilizando un método de recuento de partículas validado y documentarse en la etiqueta del producto o en el certificado de análisis.

Este valor se utiliza en el cálculo del recuento absoluto de células.

Los controles importantes incluyen:

• Concentración del número de partículas

• Tolerancia a la concentración

• Precisión de llenado

• Consistencia botella a botella

• Homogeneidad de la suspensión

• Reproducibilidad del muestreo

• Estabilidad durante el almacenamiento

• Estabilidad después del transporte.

Los productos comerciales de conteo absoluto también se basan en concentraciones de microesferas calibradas o específicas del lote en lugar del contenido de sólidos únicamente.

Tamaño de partícula uniforme

El tamaño de partícula controlado ayuda a generar una población de microesferas compactas en gráficos de dispersión frontal y lateral.

Una distribución estrecha del tamaño de las partículas puede mejorar:

• Reproducibilidad de activación

• Identificación de eventos

• Transferencia de instrumento a instrumento

• Consistencia del muestreo

• Discriminación doblete

• Comparación de lote a lote

• Análisis de datos automatizado

El tamaño nominal de partícula y el rango de tamaño permitido deben indicarse en la especificación del producto final.

Intensidad uniforme de doble fluorescencia

La intensidad de fluorescencia constante en ambos canales ayuda a producir una puerta de microesferas claramente separada.

Los atributos de calidad de fluorescencia recomendados incluyen:

• Intensidad media de fluorescencia verde

• Coeficiente de variación de fluorescencia verde.

• Intensidad media de fluorescencia del rojo lejano

• Coeficiente de variación de fluorescencia del rojo lejano.

• Porcentaje de microesferas duales positivas

• Relación de fluorescencia verde a roja lejana

• Estabilidad de la fluorescencia durante el almacenamiento.

• Detectabilidad instrumento a instrumento

Las dos señales de fluorescencia deben estar suficientemente separadas de las poblaciones celulares y conjugados de anticuerpos previstos.

Etiquetado fluorescente interno

Los tintes fluorescentes se incorporan a la estructura de las microesferas en lugar de depender únicamente de una adsorción superficial débil.

El etiquetado fluorescente interno puede ayudar a:

• Reducir la pérdida de tinte

• Mejorar la resistencia al lavado

• Mantener una superficie exterior estable

• Proteger el material fluorescente.

• Mejorar la estabilidad del almacenamiento

• Apoyar el desarrollo de reactivos a largo plazo

• Reducir la variación de fluorescencia entre lotes

El producto terminado aún debe protegerse de la exposición prolongada a una luz intensa.

Conteo absoluto de plataforma única

Las microesferas y las células diana se adquieren durante la misma ejecución de citometría de flujo.

Esto permite al usuario calcular la concentración celular sin depender exclusivamente de un analizador de hematología independiente o un contador de partículas externo.

El método de plataforma única puede reducir la variación introducida al transferir resultados porcentuales entre diferentes instrumentos. Los productos oficiales de cuentas de Thermo Fisher y Beckman Coulter utilizan el mismo principio basado en proporciones.

Adecuado para desarrollo de reactivos y fabricación a granel

Las microesferas SHBC Double-Fluo están diseñadas para clientes que requieren más que un pequeño paquete de investigación.

Las etapas del proyecto disponibles pueden incluir:

• Evaluación inicial de microesferas.

• Pruebas de compatibilidad con citómetros de flujo

• Desarrollo del método de puerta

• Desarrollo de reactivos de recuento absoluto

• Pruebas de compatibilidad con panel de anticuerpos

• Fabricación piloto

• Estudios de estabilidad

• Validación de procesos

• producción a granel

• Reserva de lote

• Fabricación OEM y ODM

Especificaciones técnicas

La siguiente información debe confirmarse y agregarse antes de la publicación formal:

• Número de catálogo

• Tamaño nominal de partículas

• Tolerancia del tamaño de partículas

• Matriz de microesferas

• Perlas/mL específicas del lote

• Tolerancia a la concentración de recuento de partículas

• Tampón de suspensión

• tensioactivo

• Preservativo

• Tamaño del paquete

• Temperatura de almacenamiento

• Duración

Contenido de sólidos frente a concentración del número de cuentas

El contenido de sólidos y la concentración del número de partículas describen diferentes propiedades del producto.

¿Qué significa 0,5% de sólidos?

Una suspensión al 0,5% peso por volumen contiene aproximadamente:

5 mg de microesferas por mililitro

El contenido de sólidos describe la masa total de material de microesferas en un volumen determinado.

Es útil para el control de fabricación, dilución y formulación.

¿Qué significa perlas/mL?

Perlas/mL describe el número de microesferas individuales en un mililitro.

Este valor depende de:

• Diámetro de las microesferas

• Densidad de partículas

• Distribución del tamaño de partículas

• Concentración de sólidos

• Nivel agregado

• Método de recuento de partículas

Dos productos de microesferas pueden tener el mismo contenido de sólidos del 0,5% pero valores de perlas/ml muy diferentes si sus tamaños de partículas son diferentes.

¿Qué valor se utiliza para el conteo absoluto?

La fórmula del recuento absoluto de células requiere la concentración del número de partículas calibradas, no sólo el contenido de sólidos.

Por lo tanto, el COA debería proporcionar una concentración específica del lote, como por ejemplo:

• 8,5 × 10⁵ perlas/ml

• 1,0 × 10⁶ perlas/ml

• Un número específico de perlas por volumen de prueba recomendado

Los ejemplos anteriores ilustran únicamente los formatos de informes y no son especificaciones de producto.

Cómo funcionan las microesferas de conteo absoluto

Se añade un volumen conocido de microesferas Double-Fluo a un volumen conocido de la muestra.

Durante la adquisición, el citómetro de flujo registra:

• El número de eventos de células objetivo.

• El número de eventos de microesferas de conteo.

Como se conoce el número de microesferas añadidas al tubo, la concentración original de células diana se puede calcular a partir de la proporción de eventos.

Un proceso típico incluye:

1. Prepare o tiña la muestra de células.

2. Lise los glóbulos rojos si es necesario.

3. Mezclar bien la suspensión de microesferas de recuento.

4. Agregue un volumen de microesferas medido con precisión.

5. Adquirir la muestra sin perder células ni microesferas.

6. Controle la población de células objetivo.

7. Puerta a la población de Microesferas de Doble Fluo.

8. Registre los números de eventos de células y microesferas.

9. Calcule la concentración celular absoluta.

10. Aplique cualquier factor de dilución de muestra requerido.

Fórmula de cálculo del recuento absoluto de células

El cálculo general es:

Concentración celular absoluta = Eventos celulares ÷ Eventos de perlas × Concentración de perlas × Volumen de perlas ÷ Volumen de muestra × Factor de dilución

Cuando el resultado se expresa en células por microlitro:

Células/μL = (Eventos celulares / Eventos de perlas) × Concentración de perlas en perlas/μL × (Volumen de perlas / Volumen de muestra) × Factor de dilución

Dónde:

• Los eventos de celda son eventos dentro de la puerta de celda objetivo validada.

• Los eventos de cuentas son eventos dentro de la puerta validada de microesferas de doble flujo.

• La concentración de perlas es el valor específico del lote indicado en el COA.

• El volumen de perlas es el volumen real de suspensión de perlas agregada.

• El volumen de muestra es el volumen de muestra original utilizado para el cálculo.

• El factor de dilución representa cualquier dilución aplicable.

Cálculo simplificado

Cuando los volúmenes de perlas y de muestra son iguales:

Células/μL = Eventos celulares ÷ Eventos de perlas × Concentración de perlas en perlas/μL

Esta fórmula simplificada sólo es válida cuando el diseño de preparación de la muestra respalda el supuesto.

Los métodos de cuentas de recuento de Thermo Fisher y Beckman Coulter utilizan la misma relación subyacente entre los eventos de las células diana y los eventos de las microesferas analizadas.

¿Por qué utilizar microesferas de conteo de doble flujo?

Confirme la identidad de las microesferas en dos canales

Una población de recuento identificada utilizando únicamente dispersión o una señal fluorescente puede superponerse con restos de muestra u otros eventos fluorescentes.

Una firma fluorescente dual proporciona un nivel adicional de identificación de microesferas.

Las posibles opciones de activación incluyen:

• Fluorescencia de 530 nm sola

• Fluorescencia de 670 nm sola

• 530 nm frente a 670 nm

• FSC frente a 530 nm

• SSC versus 670 nm

• Puerta de microesferas doble positiva

Reducir la dependencia únicamente del scatter

La dispersión frontal y lateral puede variar con:

• Modelo de citómetro

• Alineación láser

• Tensión del detector

• Matriz de muestra

• Índice de refracción de partículas

• Configuración de umbral

• Mantenimiento de instrumentos

La identificación basada en fluorescencia puede ayudar a mantener la detección de microesferas cuando la separación por dispersión es limitada.

Soporte para instrumentos láser azul y rojo

Muchos citómetros de flujo multicolores contienen láseres azules y rojos.

Las microesferas Double-Fluo permiten a los fabricantes desarrollar reactivos de recuento compatibles con:

• Detección de láser azul

• Detección por láser rojo

• Confirmación con doble láser

• Diferentes configuraciones de filtro

• Diferentes paneles de anticuerpos

Mejorar el control de calidad interno

Cuando se establece una relación de fluorescencia dual definida, los usuarios pueden monitorear:

• Pérdida de una señal de fluorescencia.

• Colocación incorrecta de la puerta

• Fallo del canal óptico

• Contaminación de la muestra

• Agregación de microesferas

• Relación de señal anormal

• Cambios en la configuración del instrumento

Soporte de análisis automatizado

Una población compacta de microesferas doblemente positivas puede ayudar a simplificar la identificación automatizada mediante software de análisis.

La activación automática aún debe validarse en:

• Múltiples lotes

• Múltiples instrumentos

• Múltiples operadores

• Diferentes matrices de muestra

• Concentraciones celulares bajas y altas.

Compatibilidad con citómetro de flujo y detector

Canal láser azul

La configuración nominal del láser azul es:

• Excitación: aproximadamente 488 nm

• Emisión: aproximadamente 530 nm

Las posibles configuraciones iniciales del detector incluyen filtros centrados cerca de la región de fluorescencia verde.

El ancho de banda del filtro real debe seleccionarse de acuerdo con el espectro de microesferas y el panel de anticuerpos.

Canal de láser rojo

La configuración nominal del láser rojo es:

• Excitación: aproximadamente 633 nm

• Emisión: aproximadamente 670 nm

Los instrumentos que utilizan láseres rojos de 635 nm o 640 nm pueden ser compatibles después de la verificación.

Consideraciones del panel de anticuerpos

El canal de 530 nm puede superponerse con conjugados de anticuerpos emisores de verde comunes.

El canal de 670 nm puede superponerse con fluoróforos del rojo lejano.

Durante el desarrollo del panel, evalúe:

• Superposición de fluorescencia

• Derrame espectral

• Requisitos de compensación

• Saturación del detector

• Brillo de las microesferas

• Intensidad del marcador celular

• Canales no utilizados disponibles

La puerta de las microesferas se puede establecer utilizando el canal que proporcione la mejor separación de las poblaciones de células teñidas.

Citómetros convencionales y espectrales

Las microesferas Double-Fluo se pueden evaluar en:

• Citómetros de flujo convencionales basados ​​en filtros

• Citómetros de flujo espectral

• Citómetros de flujo de mesa

• Analizadores de citometría de flujo automatizados

• Plataformas de análisis celular con muestreo volumétrico.

• Clasificadores de células de investigación

Para los citómetros espectrales, se debe medir la firma de fluorescencia completa e incluirla en la biblioteca de referencia, si corresponde.

Aplicaciones recomendadas

Enumeración absoluta de células inmunes

Las microesferas pueden evaluarse para la enumeración absoluta de:

• Leucocitos totales

• células T

• Células T CD4 positivas

• Células T CD8 positivas

• células B

• Células asesinas naturales

• monocitos

• Granulocitos

• Poblaciones de células dendríticas

• Otros subconjuntos de células inmunes cerradas

La población objetivo se define utilizando el panel de anticuerpos validado del laboratorio y la estrategia de selección.

Inmunofenotipado por citometría de flujo

Se pueden agregar microesferas Double-Fluo a los flujos de trabajo de inmunofenotipado para convertir porcentajes de células en números absolutos.

Los posibles formatos de investigación incluyen:

• Inmunofenotipado en sangre total

• Ensayos de lisado sin lavado

• Análisis PBMC

• Investigación de médula ósea

• Análisis de cultivos celulares

• Estudios de vigilancia inmunológica

• Investigación preclínica

• Desarrollo de procesos de terapia celular.

Monitoreo de cultivos celulares y bioprocesos

Las posibles aplicaciones de investigación incluyen:

• Recuento de células inmunes cultivadas

• Monitoreo de la expansión de células T

• Monitoreo de cultivos de células NK

• Estudios de recuperación celular.

• Desarrollo de procesos de fabricación de células.

• Investigación sobre viabilidad y rendimiento celular.

• Muestreo de bioprocesos

Los tintes de viabilidad y las microesferas de recuento se pueden combinar cuando el panel de fluorescencia proporciona suficiente separación de canales.

Investigación de células madre y progenitoras

Las microesferas pueden evaluarse en flujos de trabajo de investigación que involucran:

• Enumeración de células CD34 positivas

• Investigación de progenitores hematopoyéticos.

• Recuperación del procesamiento celular

• Estudios de criopreservación

• Desarrollo de procesos de terapia celular.

Se requiere validación específica del método.

Microorganismos y recuento de partículas.

Después de una validación adecuada, el mismo principio basado en ratios puede evaluarse para:

• Levadura

• bacterias

• Microalgas

• Partículas sintéticas

• Preparaciones de vesículas extracelulares.

• Partículas ambientales

El tamaño de partícula, el umbral de dispersión y la separación de fluorescencia deben ser adecuados para el objetivo.

Desarrollo de instrumentos y métodos

El producto también puede admitir:

• Desarrollo del método del citómetro de flujo.

• Optimización de la preparación de muestras

• Validación del método de pipeteo

• Formación de operadores

• Desarrollo de control de software

• Estudios de precisión de conteo

• Comparación entre instrumentos

• Desarrollo de reactivos de conteo OEM

Flujo de trabajo de citometría de flujo recomendado

Paso 1: preparar la muestra

Prepare un volumen conocido de la muestra biológica.

Registro:

• Volumen de muestra original

• Cualquier predilución

• Volumen de tinción

• volumen de lisis

• Factor de dilución final

• Cualquier paso de lavado

La pérdida de células durante el lavado puede afectar la relación entre el resultado medido y la muestra original.

Paso 2: teñir las células

Agregue el panel de anticuerpos requerido e incube según el método validado.

Proteja los reactivos fluorescentes de la exposición innecesaria a la luz.

Paso 3: Lise los glóbulos rojos si es necesario

Para aplicaciones de sangre completa, utilice un método de lisis validado.

Un flujo de trabajo de lisis sin lavado puede reducir la pérdida de células, pero se debe confirmar la compatibilidad con la suspensión de microesferas y el panel de anticuerpos.

Paso 4: mezclar las microesferas

Inmediatamente antes de pipetear:

• Lleve el producto a la temperatura de funcionamiento requerida.

• Mezclar según las instrucciones validadas.

• Confirme que no quede ninguna capa asentada.

• Evite generar espuma.

• Evite el vórtice prolongado a alta velocidad a menos que esté validado.

• Inspeccione si hay agregados visibles.

AccuCheck recomienda mezclar cuidadosamente y pipetear en sentido inverso para mejorar la precisión del recuento.

Paso 5: Pipetee un volumen de microesferas preciso

Utilice una pipeta calibrada.

Para un trabajo cuantitativo crítico, considere:

• Pipeteo inverso

• Consejos de baja retención

• Profundidad de aspiración constante

• Velocidad de pipeteo constante

• Dispensación con punta húmeda

• Verificación de pipeta gravimétrica

• Replicar estudios de dispensación.

Paso 6: Adquiera la muestra lo antes posible

Después de añadir las microesferas:

• Mezclar suavemente.

• Evite demoras prolongadas antes de la adquisición.

• Mantener la muestra protegida de la luz.

• Evite asentamientos innecesarios.

• Mantenga un tiempo de adquisición consistente.

Paso 7: recopilar suficientes eventos de microesferas

Para el trabajo de desarrollo, recopilar al menos 1000 eventos de microesferas es un objetivo inicial útil, según el flujo de trabajo de AccuCheck. El requisito del evento final debe establecerse a partir de la precisión necesaria para el método específico.

Un número bajo de eventos de microesferas puede aumentar la incertidumbre estadística.

Paso 8: Aplicar las puertas validadas

Registro:

• Total de eventos de microesferas

• Eventos de celda objetivo

• Eventos agregados excluidos

• tiempo de adquisición

• Volumen total analizado, cuando esté disponible

• Configuración del instrumento

Paso 9: Calcule el resultado

Utilice la concentración de microesferas específica del lote y la fórmula validada.

No sustituya el contenido de sólidos del 0,5 % por la concentración del número de partículas.

Estrategia de puerta sugerida

Puerta 1: Estabilidad del tiempo

Trazar el tiempo frente a un canal de fluorescencia o la tasa total de eventos.

Excluir períodos que muestren:

• Flujo interrumpido

• Zuecos de muestra

• Cambios repentinos en la tasa de eventos

• burbujas de aire

• Asentamiento de microesferas

• Inestabilidad de aspiración de muestra.

Puerta 2: Puerta de partículas anchas

Utilice FSC y SSC para incluir:

• Células objetivo

• Contando microesferas

Excluir:

• Ruido electrónico

• escombros muy pequeños

• Agregados extremos

No establezca el umbral tan alto que se eliminen las microesferas contadas.

Puerta 3: Puerta de fluorescencia de microesferas

Trazar fluorescencia de 530 nm contra fluorescencia de 670 nm.

Defina la región validada de microesferas de doble fluo.

La población de microesferas debería mostrar una relación consistente entre las dos señales de fluorescencia.

Puerta 4: Microesferas singlete

Cuando la geometría de pulso esté disponible, use:

• Área versus altura

• Área versus ancho

Excluir agregados de microesferas y eventos coincidentes.

Puerta 5: Población de células objetivo

Aplicar las puertas de inmunofenotipado validadas por el laboratorio.

Los marcadores potenciales pueden incluir:

• CD45

• CD3

• CD4

• CD8

• CD19

• CD16

• CD56

• CD14

• Marcadores de viabilidad

Puerta 6: Revisión final del evento

Confirmar:

• Separación de puerta de microesferas

• Recuento adecuado de eventos de cuentas

• Relación de fluorescencia de cuentas estable

• Distribución esperada de la población celular.

• Ausencia de gran inestabilidad en las adquisiciones.

• Controles válidos

Factores que afectan la precisión absoluta del conteo

Precisión de concentración de microesferas

El valor de cuentas/ml afecta directamente al resultado de la celda calculado.

Un error en la concentración de microesferas asignada produce un error proporcional en la concentración celular calculada.

Precisión de pipeteo

El cálculo supone que realmente se añadió el volumen indicado de microesferas.

Las posibles fuentes de error incluyen:

• Calibración de pipetas

• Retención de puntas

• Dispensación incompleta

• burbujas de aire

• Profundidad de aspiración incorrecta

• Asentamiento de microesferas

• Técnica del operador

Thermo Fisher señala que la precisión del conteo depende en gran medida del manejo de la muestra y de la entrega precisa del volumen de las perlas.

Homogeneidad de la suspensión

Las microesferas pueden asentarse con el tiempo.

Si la suspensión no es homogénea, diferentes alícuotas pueden contener diferente número de microesferas.

Formación agregada

Los agregados pueden contarse como:

• un evento

• Un evento excluido

• Un evento similar a una célula

• Un evento fluorescente anormal

Por lo tanto, el control agregado es importante para un conteo preciso.

Estadísticas de eventos

La precisión de un cálculo basado en proporciones depende del número de eventos de células y microesferas registrados.

Los recuentos de eventos muy bajos aumentan la variación estadística.

Consistencia de entrada

Cambiar la microesfera o la puerta de la celda entre muestras puede cambiar el resultado calculado.

Las plantillas de análisis automatizadas o bloqueadas pueden mejorar la coherencia después de la validación.

Configuración de umbral

Un umbral alto de FSC o SSC puede eliminar pequeñas microesferas de recuento.

Se puede considerar un umbral basado en fluorescencia cuando sea compatible con el panel de anticuerpos completo.

Pérdida de muestra

La centrifugación, la aspiración y el lavado pueden eliminar células o microesferas.

El resultado calculado debe interpretarse de acuerdo con el flujo de trabajo de preparación de muestras.

Coincidencia y alta tasa de eventos

Las tasas de eventos excesivas pueden causar el paso coincidente de múltiples partículas a través del punto de detección.

Diluya la muestra o reduzca el caudal cuando sea necesario.

Estabilidad del instrumento

Cambios en:

• potencia del láser

• Fluidica

• Alineación óptica

• Tensión del detector

• Rendimiento del filtro

• Caudal

puede afectar la identificación de microesferas y la reproducibilidad del conteo.

Guía de solución de problemas

Las microesferas no son visibles

Posibles causas:

• El umbral es demasiado alto

• Canal de fluorescencia incorrecto

• Láser incorrecto seleccionado

• El voltaje del detector es demasiado bajo

• Las microesferas se han asentado.

• La muestra no se mezcló

• El filtro de fluorescencia es incompatible

• La concentración de microesferas es demasiado baja.

• El producto estuvo expuesto a condiciones dañinas.

Acciones recomendadas:

1. Reducir el umbral de dispersión.

2. Verifique los canales de 530 nm y 670 nm.

3. Confirmar disponibilidad de láser.

4. Mezclar bien la suspensión.

5. Ejecute microesferas sin células.

6. Compare con los datos de referencia específicos del lote.

La puerta de microesferas es demasiado ancha

Posibles causas:

• Agregación

• Mezcla inadecuada

• Vórtice excesivo

• Contaminación

• Saturación del detector

• Eventos mixtos singlete y doblete

• inestabilidad del instrumento

Acciones recomendadas:

• Aplicar compuerta singlete.

• Reduzca la ganancia del detector si está saturado.

• Inspeccionar la suspensión.

• Utilice tubos limpios y tampones filtrados.

• Compare el resultado con un lote de referencia retenido.

La señal verde es fuerte pero la señal roja lejana es débil

Posibles causas:

• El láser rojo no está disponible o está configurado incorrectamente

• El voltaje del detector de rojo lejano es demasiado bajo

• La longitud de onda del centro del filtro no es adecuada

• La alineación del láser rojo es deficiente

• La fluorescencia ha cambiado durante el almacenamiento.

• Se seleccionó un canal de análisis incorrecto

La señal del rojo lejano es fuerte pero la señal del verde es débil

Posibles causas:

• El láser azul no está disponible o está configurado incorrectamente

• El voltaje del detector verde es demasiado bajo

• El canal verde está ocupado o compensado incorrectamente

• Se ha instalado un filtro de emisiones incorrecto

• La señal de 530 nm está fuera de la escala de adquisición.

El recuento de células es mayor de lo esperado

Posibles causas:

• El volumen de microesferas no se entregó lo suficiente

• El valor de concentración de perlas se ingresó incorrectamente

• Las microesferas fueron excluidas de la puerta.

• Los agregados fueron excluidos como un evento

• El factor de dilución de la muestra era incorrecto

• La puerta de la celda incluía escombros o dobletes.

El recuento de células es inferior al esperado

Posibles causas:

• Volumen excesivo de microesferas

• Valor de cuentas/mL incorrectamente alto

• Pérdida de células durante el lavado.

• Células objetivo excluidas de la puerta

• Los agregados de células se cuentan como eventos únicos

• Volumen de muestra original incorrecto

• Degradación de la muestra

Los resultados varían entre réplicas

Posibles causas:

• Asentamiento de microesferas

• Mezcla inconsistente

• Variación de pipeteo

• Diferentes retrasos en la adquisición

• Recuentos bajos de eventos

• Movimiento de puerta

• Caudal variable

• Heterogeneidad muestral

Perlas de doble fluo frente a otros métodos de conteo

Las microesferas Double-Fluo son particularmente útiles cuando los usuarios requieren un estándar de conteo agregado internamente con dos canales de identificación de fluorescencia.

Control de calidad para la producción por lotes

Las microesferas de conteo absoluto requieren tanto control de calidad del material como control metrológico.

Los parámetros de lanzamiento recomendados incluyen:

Propiedades físicas

• Tamaño medio de partículas

• Distribución del tamaño de partículas

• Coeficiente de variación

• Morfología de partículas

• Porcentaje agregado

• Densidad, cuando sea relevante

• Apariencia

• Rendimiento de redispersión

Propiedades de fluorescencia

• Respuesta de excitación de 488 nm.

• Intensidad de emisión de 530 nm

• Respuesta de excitación de 633 nm.

• Intensidad de emisión de 670 nm

• Porcentaje doble positivo

• CV de fluorescencia verde

• CV de fluorescencia de rojo lejano

• Relación de intensidad de verde a rojo lejano

• Fotoestabilidad

• Estabilidad de almacenamiento

Propiedades de concentración

• Contenido de sólidos

• Perlas analizadas/mL

• Tolerancia al recuento de partículas

• Variación de botella a botella

• Precisión del volumen de llenado

• Homogeneidad muestral

• Estabilidad de la concentración asignada

Propiedades funcionales

• Separación de puerta de microesferas

• Recuperación durante la citometría de flujo.

• Acuerdo con muestras de recuento de referencia.

• Linealidad entre concentraciones celulares.

• Precisión intraejecución

• Precisión entre ejecuciones

• Reproducibilidad del operador

• Compatibilidad de instrumentos

Inspección entrante recomendada

Los fabricantes de reactivos deberían considerar analizar cada lote entrante para detectar:

1. Apariencia

2. Redispersión

3. Tamaño de partícula

4. Nivel agregado

5. Fluorescencia verde

6. Fluorescencia de color rojo lejano

7. Porcentaje doble positivo

8. Perlas/mL

9. Recuperación de citometría de flujo.

10. Comparación con un lote de referencia calificado

Estrategia de lote de referencia

Se debe conservar un lote de referencia calificado para compararlo con lotes futuros.

Los nuevos lotes se pueden evaluar utilizando:

• El mismo citómetro

• La misma configuración del detector.

• la misma muestra

• la misma pipeta

• La misma plantilla de adquisición

• El mismo método de puerta

• El mismo software de cálculo

Documentación de lotes

Los documentos disponibles o personalizados pueden incluir:

• Certificado de Análisis

• Especificación del producto

• Ficha de datos de seguridad

• Informe de tamaño de partícula

• Informe de fluorescencia

• Informe de concentración de perlas

• Datos de estabilidad

• Datos de comparación de lotes

• Notificación de cambio de fabricación

Personalización y fabricación a granel

SHBC apoya el desarrollo de microesferas fluorescentes personalizadas para fabricantes de reactivos de citometría de flujo.

Las posibles opciones de personalización incluyen:

• Tamaño de partícula

• Distribución del tamaño de partículas

• Intensidad de excitación de 488 nm.

• Intensidad de emisión de 530 nm

• Intensidad de excitación de 633 nm.

• Intensidad de emisión de 670 nm

• Relación de intensidad de verde a rojo lejano

• Contenido de sólidos

• Perlas/mL

• Tampón de suspensión

• Sistema surfactante

• Sistema conservante

• Volumen del paquete

• Formulación de baja unión

• Etiquetado OEM

• Embalaje de etiqueta privada

Oferta de desarrollo

Se pueden suministrar pequeñas cantidades para:

• Compatibilidad de instrumentos

• Desarrollo de puertas

• Evaluación de panel de anticuerpos

• Estudios de pipeteo

• Optimización de la concentración

• Cribado de estabilidad

Producción piloto

Los lotes piloto pueden soportar:

• Transferencia de proceso

• Validación de llenado

• Validación de métodos

• Comparación entre instrumentos

• Evaluación de embalaje

• Estudios de estabilidad acelerada.

Fabricación a granel

La producción a granel puede incluir:

• Reserva de lote

• Criterios de liberación específicos del cliente

• Concentración personalizada

• Embalaje personalizado

• Planificación del suministro a largo plazo

• Servicios OEM y ODM

• Documentación por lotes

Almacenamiento y manipulación

Las prácticas recomendadas incluyen:

• Almacenar entre 2 y 8 °C a menos que se indique lo contrario en la etiqueta del producto o en el COA.

• Proteja el producto de la luz directa.

• No congelar a menos que se haya validado la estabilidad de congelación y descongelación.

• Mezclar bien antes de usar.

• Evite la contaminación de la suspensión de stock.

• Utilice pipetas calibradas.

• Utilice tubos y puntas limpios y poco adherentes.

• Evite la exposición prolongada a temperaturas elevadas.

• Cerrar el frasco inmediatamente después de su uso.

• Siga la fecha de vencimiento específica del lote.

Los productos comerciales de cuentas para contar se suelen almacenar a una temperatura de 2 a 8 °C y protegidos de la luz.

Antes de usar:

1. Inspeccionar la suspensión.

2. Confirme que las microesferas asentadas se puedan redispersar.

3. Mezclar según el procedimiento validado.

4. Evite introducir espuma.

5. Pipetear inmediatamente después de mezclar.

6. Devuelva la botella a las condiciones de almacenamiento recomendadas.

Preguntas frecuentes

¿Qué son las microesferas de conteo absoluto de doble fluo?

Son microesferas fluorescentes de referencia diseñadas para la enumeración celular absoluta mediante citometría de flujo.

Las microesferas proporcionan respuestas de fluorescencia cercanas a 530 nm y 670 nm bajo una excitación de aproximadamente 488 nm y 633 nm.

¿Cuál es el contenido de sólidos?

El producto tiene un contenido de sólidos del 0,5%.

Esto corresponde a aproximadamente 5 mg de material de microesferas por mililitro cuando se expresa como peso por volumen.

¿Se puede utilizar 0,5% de sólidos directamente en la fórmula de conteo?

No.

La fórmula de conteo absoluto requiere la concentración del número de partículas específico del lote en perlas/mL o perlas/μL.

El contenido de sólidos por sí solo es insuficiente.

¿Por qué el producto necesita un valor de perlas/mL específico del lote?

La concentración celular calculada es directamente proporcional a la concentración de microesferas asignada.

Cualquier error en cuentas/mL produce un error correspondiente en el resultado del recuento de células.

¿Qué láseres se requieren?

Las longitudes de onda de excitación nominales son 488 nm y 633 nm.

También se pueden evaluar citómetros de flujo que utilizan un láser rojo de 635 nm o 640 nm.

¿Qué canales de fluorescencia se utilizan?

Los canales de emisión nominales son aproximadamente 530 nm y 670 nm.

Los filtros detectores exactos deben coincidir con los espectros de fluorescencia reales.

¿Se pueden detectar las microesferas utilizando un solo canal?

Potencialmente sí.

Sin embargo, el uso de ambos canales de fluorescencia puede mejorar la identificación de microesferas y la confianza en la activación.

El método debe validarse con el panel de anticuerpos previsto.

¿Se pueden utilizar las microesferas Double-Fluo con anticuerpos conjugados con FITC o APC?

Pueden superponerse con conjugados de anticuerpos emisores de color verde o rojo lejano.

La compatibilidad del panel, la compensación y la separación de la puerta deben evaluarse antes de su uso.

¿Se pueden utilizar las microesferas con sangre entera?

Se pueden evaluar con sangre completa y flujos de trabajo de lisis sin lavado.

Se debe validar el reactivo de lisis, el panel de anticuerpos, el volumen de muestra y el citómetro.

¿Se pueden utilizar con células cultivadas?

Sí. Pueden evaluarse para la enumeración absoluta de células cultivadas, células inmunitarias y otras suspensiones de partículas.

¿Cuántos eventos de cuentas se deben recolectar?

Se puede utilizar un mínimo de aproximadamente 1000 eventos de cuentas como objetivo inicial durante el desarrollo del método.

El requisito final debe basarse en la precisión requerida y la concentración esperada de la muestra.

¿Por qué no puedo ver las microesferas en FSC y SSC?

El umbral de dispersión puede ser demasiado alto o las microesferas pueden tener una dispersión menor que las células objetivo.

Reduzca el umbral con cuidado y utilice los canales de fluorescencia para identificar la población de microesferas.

¿Por qué se asientan las microesferas?

Las microesferas tienen una densidad diferente a la del medio de suspensión y pueden sedimentarse gradualmente durante el almacenamiento.

Mezclar bien antes de cada alícuota.

¿Se puede personalizar el tamaño de partícula?

La personalización del tamaño de las partículas puede estar disponible según la cantidad del proyecto y los requisitos técnicos.

¿Se puede personalizar la intensidad de la fluorescencia?

La intensidad del verde, la intensidad del rojo lejano y la relación entre los dos canales pueden discutirse para proyectos OEM.

¿Se puede personalizar el contenido de sólidos?

Sí. Es posible que haya diferentes contenidos de sólidos disponibles según la cantidad de producción y los requisitos del proyecto.

¿Está disponible el suministro a granel?

Sí. SHBC admite cantidades de evaluación, lotes piloto, fabricación a granel, reserva de lotes y embalaje personalizado.

¿Es este un reactivo de diagnóstico terminado?

No.

Las microesferas se suministran para uso en investigación y desarrollo de reactivos. No son un producto de diagnóstico terminado a menos que el cliente los valide y registre por separado.

Solicite una muestra o una cotización al por mayor

SHBC suministra microesferas fluorescentes de conteo absoluto de citometría de flujo de doble flujo para el recuento de células inmunitarias, la investigación de inmunofenotipado, el desarrollo de métodos de citómetro de flujo y la fabricación de reactivos por lotes.

Para solicitar una muestra, consulta técnica o cotización al por mayor, proporcione:

• Aplicación prevista

• Población celular objetivo

• tipo de muestra

• Modelo de citómetro de flujo

• Longitudes de onda láser disponibles

• Configuración del filtro del detector

• panel de anticuerpos

• Tamaño de partícula requerido

• Perlas requeridas/mL

• Contenido de sólidos requerido

• Tamaño de paquete requerido

• Demanda anual esperada

• Requisitos especiales de control de calidad.

Comuníquese con SHBC para evaluar las microesferas Double-Fluo para su proyecto de conteo absoluto de células, monitoreo inmunológico, citometría de flujo o desarrollo de reactivos OEM.