Microesferas Fluo Duplas 5um 0,5%

Microesferas Fluorescentes de Contagem Absoluta por Citometria de Fluxo

As microesferas fluorescentes de contagem absoluta de citometria de fluxo SHBC são partículas de referência fluorescentes duplas desenvolvidas para enumeração absoluta de células, imunofenotipagem por citometria de fluxo, análise de células imunológicas e pesquisa quantitativa de contagem de partículas.

As microesferas Double-Fluo apresentam dois canais de detecção de fluorescência:

• Excitação em aproximadamente 488 nm com emissão centrada perto de 530 nm

• Excitação em aproximadamente 633 nm com emissão centrada perto de 670 nm

As microesferas são fornecidas como uma suspensão aquosa com um teor de sólidos de 0,5%.

O perfil de fluorescência de dupla emissão e laser duplo permite que as microesferas sejam identificadas usando canais de laser azul e laser vermelho em citômetros de fluxo compatíveis. Quando um volume conhecido de microesferas com uma concentração de partículas testada específica do lote é adicionado a um volume de amostra conhecido, a concentração absoluta de células ou outras partículas pode ser calculada a partir da razão entre eventos de amostra e eventos de microesferas.

Este produto é destinado a instituições de pesquisa, laboratórios de citometria de fluxo, desenvolvedores de reagentes de imunofenotipagem, empresas e fabricantes de anticorpos que necessitam de amostras de desenvolvimento, quantidades piloto ou fornecimento de microesferas fluorescentes em massa.

Visão geral do produto

A citometria de fluxo geralmente informa a porcentagem de células dentro de uma população selecionada. No entanto, muitas aplicações de pesquisa também exigem o número real de células por microlitro, mililitro ou volume de amostra original.

As microesferas de contagem absoluta fornecem uma referência interna de partículas para este cálculo.

Um volume conhecido de microesferas de contagem é adicionado diretamente à amostra celular. O citômetro de fluxo registra então os eventos da célula-alvo e os eventos das microesferas durante a mesma aquisição.

Como a concentração de microesferas é conhecida, o número de células na amostra original pode ser calculado a partir da razão entre as duas populações de eventos.

As microesferas Double-Fluo fornecem duas respostas de fluorescência para identificação de microesferas:

• Fluorescência verde perto de 530 nm sob excitação de aproximadamente 488 nm

• Fluorescência vermelha distante perto de 670 nm sob excitação de aproximadamente 633 nm

O perfil fluorescente duplo pode ajudar os usuários:

• Distinguir contagem de microesferas de células não coradas

• Microesferas separadas de detritos celulares

• Confirme a identidade das microesferas em dois canais de fluorescência

• Reduza a dependência apenas dos parâmetros de dispersão

• Estabeleça um portão de microesferas compacto e reproduzível

• Citômetros de fluxo de suporte equipados com lasers azul e vermelho

• Desenvolva reagentes de contagem absoluta personalizados

• Melhore a aquisição interna e o controle de processos

As microesferas podem ser avaliadas com sangue total, sangue total lisado, células mononucleares de sangue periférico, células cultivadas, células imunes isoladas e outras suspensões de partículas.

A compatibilidade deve ser verificada com a matriz de amostra pretendida, painel de anticorpos, citômetro e fluxo de trabalho de análise de dados.

Principais recursos das microesferas Double-Fluo

Excitação dupla em 488 nm e 633 nm

As microesferas Double-Fluo são projetadas para excitação usando duas linhas de laser de citômetro de fluxo comuns:

• Excitação de laser azul de aproximadamente 488 nm

• Excitação com laser vermelho de aproximadamente 633 nm

A excitação de 488 nm fornece uma resposta fluorescente verde que pode ser detectada perto de 530 nm.

A excitação de 633 nm fornece uma resposta fluorescente vermelha distante que pode ser detectada perto de 670 nm.

Este design de laser duplo suporta citômetros de fluxo equipados com módulos de laser azul e vermelho e permite que os desenvolvedores de reagentes selecionem um ou ambos os sinais de fluorescência para identificação de microesferas.

Instrumentos que utilizam lasers vermelhos de 635 nm ou 640 nm também podem ser avaliados. A compatibilidade final depende da potência do laser, da configuração do filtro, da sensibilidade do detector e do espectro de fluorescência específico do lote.

Emissão dupla em 530 nm e 670 nm

Os canais nominais de emissão de fluorescência são:

• Aproximadamente 530 nm após excitação de 488 nm

• Aproximadamente 670 nm após excitação de 633 nm

O sinal de 530 nm está geralmente localizado na região de detecção de fluorescência verde.

O sinal de 670 nm está localizado na região de detecção de fluorescência vermelha distante.

Os dois sinais de fluorescência podem ser usados ​​individualmente ou em conjunto de acordo com o painel de anticorpos e a configuração do citômetro.

Uma porta de fluorescência dupla pode fornecer um método adicional para distinguir microesferas de contagem de:

• Células não coradas

• Fragmentos celulares

• Plaquetas

• Ruído eletrônico

• Eventos autofluorescentes

• Partículas fluorescentes de canal único

• Contaminantes de amostra inespecíficos

Os comprimentos de onda e larguras de banda exatos do centro do filtro devem ser verificados no citômetro de fluxo pretendido.

Suspensão aquosa de 0,5% de sólidos

O produto é fornecido com teor de sólidos de 0,5%.

Quando expresso em peso por volume, 0,5% de sólidos corresponde a aproximadamente 5 mg de microesferas por mililitro.

O conteúdo de sólidos é útil para:

• Controle do processo de fabricação

• Desenvolvimento de formulações

• Cálculos de diluição

• Comparação de massa lote a lote

• Preparação de concentração personalizada

• Controle do processo de enchimento

No entanto, o conteúdo de sólidos não é igual à concentração do número de partículas necessária para a contagem absoluta.

Concentração de esferas específica do lote

A contagem absoluta confiável requer uma concentração de número de partículas testada específica do lote, declarada como:

• Grânulos/mL

• Grânulos/μL

• Grânulos por volume de teste recomendado

A concentração do número de esferas deve ser medida utilizando um método de contagem de partículas validado e documentada no rótulo do produto ou certificado de análise.

Este valor é usado no cálculo da contagem absoluta de células.

Controles importantes incluem:

• Concentração do número de partículas

• Tolerância à concentração

• Precisão de preenchimento

• Consistência garrafa a garrafa

• Homogeneidade da suspensão

• Reprodutibilidade da amostragem

• Estabilidade durante o armazenamento

• Estabilidade após transporte

Os produtos comerciais de contagem absoluta também dependem de concentrações de microesferas calibradas ou específicas de lote, em vez de apenas no conteúdo de sólidos.

Tamanho de partícula uniforme

O tamanho controlado das partículas ajuda a gerar uma população compacta de microesferas em gráficos de dispersão direta e lateral.

Uma distribuição estreita do tamanho das partículas pode melhorar:

• Reprodutibilidade de controle

• Identificação do evento

• Transferência de instrumento para instrumento

• Consistência de amostragem

• Discriminação dupla

• Comparação lote a lote

• Análise automatizada de dados

O tamanho nominal das partículas e a faixa de tamanho permitida devem ser indicados na especificação do produto final.

Intensidade Uniforme de Dupla Fluorescência

A intensidade de fluorescência consistente em ambos os canais ajuda a produzir uma porta de microesferas claramente separada.

Os atributos de qualidade de fluorescência recomendados incluem:

• Intensidade média de fluorescência verde

• Coeficiente de variação de fluorescência verde

• Intensidade média de fluorescência vermelha distante

• Coeficiente de variação de fluorescência vermelha distante

• Porcentagem de microesferas duplamente positivas

• Proporção de fluorescência verde para vermelho extremo

• Estabilidade de fluorescência durante o armazenamento

• Detectabilidade instrumento a instrumento

Os dois sinais de fluorescência devem estar suficientemente separados das populações celulares pretendidas e dos conjugados de anticorpos.

Rotulagem Fluorescente Interna

Os corantes fluorescentes são incorporados na estrutura da microesfera em vez de depender apenas da fraca adsorção superficial.

A rotulagem fluorescente interna pode ajudar:

• Reduza a perda de corante

• Melhorar a resistência à lavagem

• Mantenha uma superfície externa estável

• Proteja o material fluorescente

• Melhore a estabilidade do armazenamento

• Apoie o desenvolvimento de reagentes a longo prazo

• Reduza a variação de fluorescência entre lotes

O produto acabado ainda deve ser protegido da exposição prolongada à luz forte.

Contagem Absoluta em Plataforma Única

As microesferas e as células alvo são adquiridas durante a mesma execução de citometria de fluxo.

Isto permite ao usuário calcular a concentração celular sem depender exclusivamente de um analisador hematológico separado ou de um contador de partículas externo.

O método de plataforma única pode reduzir a variação introduzida pela transferência de resultados percentuais entre diferentes instrumentos. Os produtos oficiais de contas de contagem da Thermo Fisher e Beckman Coulter usam o mesmo princípio baseado em proporção.

Adequado para desenvolvimento de reagentes e fabricação em massa

As microesferas SHBC Double-Fluo são posicionadas para clientes que exigem mais do que um pequeno pacote de pesquisa.

As etapas do projeto disponíveis podem incluir:

• Avaliação inicial de microesferas

• Teste de compatibilidade com citômetro de fluxo

• Desenvolvimento de método Gating

• Desenvolvimento de reagentes de contagem absoluta

• Teste de compatibilidade do painel de anticorpos

• Fabricação piloto

• Estudos de estabilidade

• Validação de processo

• Produção em massa

• Reserva de lote

• Fabricação OEM e ODM

Especificações Técnicas

As seguintes informações devem ser confirmadas e adicionadas antes da publicação formal:

• Número de catálogo

• Tamanho nominal de partícula

• Tolerância ao tamanho das partículas

• Matriz de microesferas

• Grânulos específicos do lote/mL

• Tolerância à concentração de contagem de partículas

• Tampão de suspensão

• Surfactante

• Conservante

• Tamanho do pacote

• Temperatura de armazenamento

• Prazo de validade

Conteúdo de sólidos vs. concentração de número de grânulos

O conteúdo de sólidos e a concentração do número de partículas descrevem diferentes propriedades do produto.

O que significa 0,5% de sólidos?

Uma suspensão de 0,5% em peso por volume contém aproximadamente:

5 mg de microesferas por mililitro

O conteúdo de sólidos descreve a massa total de material de microesferas em um determinado volume.

É útil para fabricação, diluição e controle de formulação.

O que significa contas/mL?

Grânulos/mL descreve o número de microesferas individuais em um mililitro.

Este valor depende de:

• Diâmetro da microesfera

• Densidade de partículas

• Distribuição de tamanho de partícula

• Concentração de sólidos

• Nível agregado

• Método de contagem de partículas

Dois produtos de microesferas podem ter o mesmo conteúdo de sólidos de 0,5%, mas valores de esferas/mL muito diferentes se seus tamanhos de partícula forem diferentes.

Qual valor é usado para contagem absoluta?

A fórmula de contagem absoluta de células requer a concentração calibrada do número de partículas, não apenas o conteúdo de sólidos.

O COA deve, portanto, fornecer uma concentração específica do lote, tal como:

• 8,5 × 10⁵ esferas/mL

• 1,0 × 10⁶ esferas/mL

• Um número especificado de esferas por volume de teste recomendado

Os exemplos acima ilustram apenas formatos de relatórios e não são especificações de produtos.

Como funcionam as microesferas de contagem absoluta

Um volume conhecido de microesferas Double-Fluo é adicionado a um volume conhecido da amostra.

Durante a aquisição, o citômetro de fluxo registra:

• O número de eventos da célula-alvo

• O número de eventos de contagem de microesferas

Como o número de microesferas adicionadas ao tubo é conhecido, a concentração original de células alvo pode ser calculada a partir da proporção de eventos.

Um processo típico inclui:

1. Prepare ou core a amostra de células.

2. Lisar glóbulos vermelhos, se necessário.

3. Misture bem a suspensão de microesferas de contagem.

4. Adicione um volume medido com precisão de microesferas.

5. Adquira a amostra sem perder células ou microesferas.

6. Gate a população de células-alvo.

7. Gate a população de microesferas Double-Fluo.

8. Registre os números de eventos de células e microesferas.

9. Calcule a concentração celular absoluta.

10. Aplique qualquer fator de diluição de amostra necessário.

Fórmula de cálculo de contagem absoluta de células

O cálculo geral é:

Concentração celular absoluta = Eventos celulares ÷ Eventos de esferas × Concentração de esferas × Volume de esferas ÷ Volume de amostra × Fator de diluição

Quando o resultado é expresso em células por microlitro:

Células/μL = (Eventos celulares/Eventos de esferas) × Concentração de esferas em esferas/μL × (Volume de esferas/Volume de amostra) × Fator de diluição

Onde:

• Eventos de célula são eventos dentro do portão da célula-alvo validado.

• Os eventos de esfera são eventos dentro da porta validada da microesfera Double-Fluo.

• A concentração de esferas é o valor específico do lote indicado no COA.

• O volume do grânulo é o volume real de suspensão do grânulo adicionado.

• O volume da amostra é o volume da amostra original usado para o cálculo.

• O fator de diluição é responsável por qualquer diluição aplicável.

Cálculo Simplificado

Quando os volumes do cordão e da amostra são iguais:

Células/μL = Eventos celulares ÷ Eventos de esferas × Concentração de esferas em esferas/μL

Esta fórmula simplificada só é válida quando o desenho de preparação da amostra apoia a suposição.

Os métodos de contagem de esferas Thermo Fisher e Beckman Coulter usam a mesma proporção subjacente entre eventos de células-alvo e eventos de microesferas analisados.

Por que usar microesferas de contagem dupla Fluo?

Confirme a identidade da microesfera em dois canais

Uma população de contagem identificada usando apenas dispersão ou um sinal fluorescente pode se sobrepor a detritos de amostra ou outros eventos fluorescentes.

Uma assinatura fluorescente dupla fornece um nível adicional de identificação de microesferas.

As possíveis opções de bloqueio incluem:

• Fluorescência de 530 nm sozinha

• Fluorescência de 670 nm sozinha

• 530 nm versus 670 nm

• FSC versus 530 nm

• SSC versus 670 nm

• Gating de microesferas duplamente positivas

Reduza a dependência apenas da dispersão

A dispersão frontal e lateral pode variar com:

• Modelo de citômetro

• Alinhamento a laser

• Tensão do detector

• Matriz de amostra

• Índice de refração de partículas

• Configurações de limite

• Manutenção de instrumentos

A identificação baseada em fluorescência pode ajudar a manter a detecção de microesferas quando a separação por dispersão é limitada.

Suporta instrumentos laser azul e vermelho

Muitos citômetros de fluxo multicoloridos contêm lasers azuis e vermelhos.

As microesferas Double-Fluo permitem que os fabricantes desenvolvam reagentes de contagem compatíveis com:

• Detecção de laser azul

• Detecção de laser vermelho

• Confirmação de laser duplo

• Diferentes configurações de filtro

• Diferentes painéis de anticorpos

Melhore o controle interno de qualidade

Quando uma relação definida de dupla fluorescência é estabelecida, os usuários podem monitorar:

• Perda de um sinal de fluorescência

• Colocação incorreta do portão

• Falha no canal óptico

• Contaminação de amostra

• Agregação de microesferas

• Relação de sinal anormal

• Mudanças nas configurações do instrumento

Suporte à análise automatizada

Uma população compacta de microesferas duplamente positivas pode ajudar a simplificar a identificação automatizada por software de análise.

O gate automatizado ainda deve ser validado em:

• Vários lotes

• Vários instrumentos

• Vários operadores

• Diferentes matrizes de amostra

• Concentrações celulares baixas e altas

Compatibilidade com citômetro de fluxo e detector

Canal Laser Azul

A configuração nominal do laser azul é:

• Excitação: aproximadamente 488 nm

• Emissão: aproximadamente 530 nm

As possíveis configurações iniciais do detector incluem filtros centrados perto da região de fluorescência verde.

A largura de banda real do filtro deve ser selecionada de acordo com o espectro da microesfera e o painel de anticorpos.

Canal Laser Vermelho

A configuração nominal do laser vermelho é:

• Excitação: aproximadamente 633 nm

• Emissão: aproximadamente 670 nm

Instrumentos que utilizam lasers vermelhos de 635 nm ou 640 nm podem ser compatíveis após verificação.

Considerações sobre o painel de anticorpos

O canal de 530 nm pode se sobrepor a conjugados de anticorpos emissores verdes comuns.

O canal de 670 nm pode se sobrepor a fluoróforos vermelhos distantes.

Durante o desenvolvimento do painel, avalie:

• Sobreposição de fluorescência

• Transbordamento espectral

• Requisitos de compensação

• Saturação do detector

• Brilho da microesfera

• Intensidade do marcador celular

• Canais não utilizados disponíveis

A porta de microesferas pode ser estabelecida utilizando o canal que proporciona a melhor separação das populações de células coradas.

Citômetros Convencionais e Espectrais

As microesferas Double-Fluo podem ser avaliadas em:

• Citômetros de fluxo convencionais baseados em filtro

• Citômetros de fluxo espectral

• Citômetros de fluxo de bancada

• Analisadores automatizados de citometria de fluxo

• Plataformas de análise celular com amostragem volumétrica

• Classificadores de células de pesquisa

Para citômetros espectrais, a assinatura completa de fluorescência deve ser medida e incluída na biblioteca de referência, se apropriado.

Aplicativos recomendados

Enumeração absoluta de células imunológicas

As microesferas podem ser avaliadas para enumeração absoluta de:

• Leucócitos totais

• Células T

• Células T CD4 positivas

• Células T positivas para CD8

• Células B

• Células assassinas naturais

• Monócitos

• Granulócitos

• Populações de células dendríticas

• Outros subconjuntos de células imunológicas fechadas

A população-alvo é definida usando o painel de anticorpos validado pelo laboratório e a estratégia de gating.

Imunofenotipagem por Citometria de Fluxo

As microesferas Double-Fluo podem ser adicionadas aos fluxos de trabalho de imunofenotipagem para converter porcentagens de células em números absolutos.

Os possíveis formatos de pesquisa incluem:

• Imunofenotipagem de sangue total

• Ensaios de lise sem lavagem

• Análise PBMC

• Pesquisa de medula óssea

• Análise de cultura celular

• Estudos de monitoramento imunológico

• Pesquisa pré-clínica

• Desenvolvimento do processo de terapia celular

Cultura Celular e Monitoramento de Bioprocessos

As possíveis aplicações de pesquisa incluem:

• Contagem de células imunológicas cultivadas

• Monitoramento de expansão de células T

• Monitoramento de cultura de células NK

• Estudos de recuperação celular

• Desenvolvimento do processo de fabricação de células

• Viabilidade celular e pesquisa de rendimento

• Amostragem de bioprocessos

Corantes de viabilidade e microesferas de contagem podem ser combinados quando o painel de fluorescência fornece separação suficiente de canais.

Pesquisa com células-tronco e progenitoras

As microesferas poderão ser avaliadas em fluxos de trabalho de pesquisa envolvendo:

• Contagem de células positivas para CD34

• Pesquisa de progenitores hematopoiéticos

• Recuperação de processamento celular

• Estudos de criopreservação

• Desenvolvimento do processo de terapia celular

A validação específica do método é necessária.

Contagem de microrganismos e partículas

Após validação apropriada, o mesmo princípio baseado em proporção pode ser avaliado para:

• Levedura

• Bactérias

• Microalgas

• Partículas sintéticas

• Preparações de vesículas extracelulares

• Partículas ambientais

O tamanho das partículas, o limiar de dispersão e a separação de fluorescência devem ser adequados ao alvo.

Desenvolvimento de instrumentos e métodos

O produto também pode suportar:

• Desenvolvimento de método de citômetro de fluxo

• Otimização da preparação de amostras

• Validação do método de pipetagem

• Treinamento de operadores

• Desenvolvimento de software

• Estudos de precisão de contagem

• Comparação entre instrumentos

• Desenvolvimento de reagentes de contagem OEM

Fluxo de trabalho de citometria de fluxo recomendado

Passo 1: Preparar a Amostra

Prepare um volume conhecido da amostra biológica.

Registro:

• Volume da amostra original

• Qualquer pré-diluição

• Volume de coloração

• Volume de lise

• Fator de diluição final

• Qualquer etapa de lavagem

A perda de células durante a lavagem pode afetar a relação entre o resultado medido e a amostra original.

Etapa 2: manchar as células

Adicione o painel de anticorpos necessário e incube de acordo com o método validado.

Proteja os reagentes fluorescentes da exposição desnecessária à luz.

Etapa 3: lisar glóbulos vermelhos, se necessário

Para aplicações de sangue total, utilize um método de lise validado.

Um fluxo de trabalho de lise sem lavagem pode reduzir a perda de células, mas a compatibilidade com a suspensão de microesferas e o painel de anticorpos deve ser confirmada.

Etapa 4: misture as microesferas

Imediatamente antes da pipetagem:

• Leve o produto à temperatura operacional necessária.

• Misture de acordo com as instruções validadas.

• Confirme que nenhuma camada assentada permanece.

• Evite gerar espuma.

• Evite vórtice prolongado em alta velocidade, a menos que seja validado.

• Inspecione quanto a agregados visíveis.

AccuCheck recomenda mistura cuidadosa e pipetagem reversa para melhorar a precisão da contagem.

Etapa 5: pipetar um volume preciso de microesferas

Use uma pipeta calibrada.

Para trabalho quantitativo crítico, considere:

• Pipetagem reversa

• Dicas de baixa retenção

• Profundidade de aspiração consistente

• Velocidade de pipetagem consistente

• Dispensação de ponta úmida

• Verificação de pipeta gravimétrica

• Replicar estudos de dispensação

Etapa 6: Adquira a amostra imediatamente

Depois de adicionar as microesferas:

• Misture delicadamente.

• Evite atrasos prolongados antes da aquisição.

• Mantenha a amostra protegida da luz.

• Evite assentamentos desnecessários.

• Mantenha um tempo de aquisição consistente.

Etapa 7: coletar eventos de microesferas suficientes

Para o trabalho de desenvolvimento, coletar pelo menos 1.000 eventos de microesferas é um objetivo inicial útil, com base no fluxo de trabalho do AccuCheck. O requisito do evento final deve ser estabelecido a partir da precisão necessária para o método específico.

Números baixos de eventos de microesferas podem aumentar a incerteza estatística.

Etapa 8: Aplicar as portas validadas

Registro:

• Eventos totais de microesferas

• Eventos de célula alvo

• Eventos agregados excluídos

• Tempo de aquisição

• Volume total analisado, quando disponível

• Configurações do instrumento

Etapa 9: Calcule o resultado

Utilize a concentração de microesferas específica do lote e a fórmula validada.

Não substitua o teor de sólidos de 0,5% pela concentração do número de partículas.

Estratégia de bloqueio sugerida

Portão 1: Estabilidade de Tempo

Plote o tempo em relação a um canal de fluorescência ou taxa total de eventos.

Excluir períodos mostrando:

• Fluxo interrompido

• Amostra de tamancos

• Mudanças repentinas na taxa de eventos

• Bolhas de ar

• Assentamento de microesferas

• Instabilidade de aspiração de amostra

Portão 2: Portão de Partículas Amplo

Use FSC e SSC para incluir:

• Células alvo

• Contando microesferas

Excluir:

• Ruído eletrônico

• Detritos muito pequenos

• Agregados extremos

Não defina o limite tão alto que a contagem de microesferas seja removida.

Portão 3: Portão de Fluorescência da Microesfera

Plote a fluorescência de 530 nm contra a fluorescência de 670 nm.

Defina a região validada da microesfera Double-Fluo.

A população de microesferas deve mostrar uma relação consistente entre os dois sinais de fluorescência.

Portão 4: Microesferas Singlete

Onde a geometria do pulso estiver disponível, use:

• Área versus altura

• Área versus largura

Exclua agregados de microesferas e eventos coincidentes.

Portão 5: População de Células Alvo

Aplique os portões de imunofenotipagem validados pelo laboratório.

Marcadores potenciais podem incluir:

• CD45

• CD3

• CD4

• CD8

• CD19

• CD16

• CD56

• CD14

• Marcadores de viabilidade

Portão 6: Revisão Final do Evento

Confirmar:

• Separação da porta da microesfera

• Contagem adequada de eventos de contas

• Razão de fluorescência estável do grânulo

• Distribuição esperada da população celular

• Ausência de grande instabilidade de aquisição

• Controles válidos

Fatores que afetam a precisão da contagem absoluta

Precisão da concentração de microesferas

O valor de esferas/mL afeta diretamente o resultado calculado da célula.

Um erro na concentração de microesferas atribuída produz um erro proporcional na concentração celular calculada.

Precisão de pipetagem

O cálculo assume que o volume declarado de microesferas foi realmente adicionado.

Possíveis fontes de erro incluem:

• Calibração de pipeta

• Retenção de gorjeta

• Dispensação incompleta

• Bolhas de ar

• Profundidade de aspiração incorreta

• Assentamento de microesferas

• Técnica do operador

A Thermo Fisher observa que a precisão da contagem depende fortemente do manuseio da amostra e da entrega precisa do volume de esferas.

Homogeneidade da Suspensão

As microesferas podem assentar com o tempo.

Se a suspensão não for homogénea, diferentes alíquotas poderão conter diferentes números de microesferas.

Formação Agregada

Os agregados podem ser contados como:

• Um evento

• Um evento excluído

• Um evento semelhante a uma célula

• Um evento fluorescente anormal

O controle agregado é, portanto, importante para uma contagem precisa.

Estatísticas de eventos

A precisão de um cálculo baseado em razão depende do número de eventos registrados de células e microesferas.

Contagens de eventos muito baixas aumentam a variação estatística.

Consistência de bloqueio

Alterar a microesfera ou a porta da célula entre amostras pode alterar o resultado calculado.

Modelos de análise automatizados ou bloqueados podem melhorar a consistência após a validação.

Configurações de limite

Um limite alto de FSC ou SSC pode remover pequenas microesferas de contagem.

Um limiar baseado em fluorescência pode ser considerado quando compatível com o painel completo de anticorpos.

Perda de amostra

Centrifugação, aspiração e lavagem podem remover células ou microesferas.

O resultado calculado deve ser interpretado de acordo com o fluxo de trabalho de preparação da amostra.

Coincidência e alta taxa de eventos

Taxas excessivas de eventos podem causar a passagem coincidente de múltiplas partículas através do ponto de detecção.

Dilua a amostra ou reduza a vazão quando necessário.

Estabilidade do Instrumento

Mudanças em:

• Potência laser

• Fluídica

• Alinhamento óptico

• Tensão do detector

• Desempenho do filtro

• Taxa de fluxo

pode afetar a identificação de microesferas e a reprodutibilidade da contagem.

Guia de solução de problemas

Microesferas não são visíveis

Possíveis causas:

• O limite é muito alto

• Canal de fluorescência incorreto

• Laser incorreto selecionado

• A tensão do detector está muito baixa

• As microesferas se estabeleceram

• A amostra não foi misturada

• O filtro de fluorescência é incompatível

• A concentração de microesferas é muito baixa

• O produto foi exposto a condições prejudiciais

Ações recomendadas:

1. Reduza o limite de dispersão.

2. Verifique os canais de 530 nm e 670 nm.

3. Confirme a disponibilidade do laser.

4. Misture bem a suspensão.

5. Execute microesferas sem células.

6. Compare com os dados de referência específicos do lote.

O portão da microesfera é muito amplo

Possíveis causas:

• Agregação

• Mistura inadequada

• Vórtice excessivo

• Contaminação

• Saturação do detector

• Eventos mistos de singleto e dupleto

• Instabilidade do instrumento

Ações recomendadas:

• Aplique o gate singlete.

• Reduza o ganho do detector se estiver saturado.

• Inspecione a suspensão.

• Use tubos limpos e tampões filtrados.

• Compare o resultado com um lote de referência retido.

O sinal verde é forte, mas o sinal vermelho extremo é fraco

Possíveis causas:

• O laser vermelho não está disponível ou está configurado incorretamente

• A tensão do detector vermelho distante está muito baixa

• O comprimento de onda do centro do filtro é inadequado

• O alinhamento do laser vermelho é ruim

• A fluorescência mudou durante o armazenamento

• O canal de análise incorreto foi selecionado

O sinal vermelho distante é forte, mas o sinal verde é fraco

Possíveis causas:

• O laser azul não está disponível ou está configurado incorretamente

• A tensão do detector verde está muito baixa

• O canal verde está ocupado ou compensado incorretamente

• Filtro de emissão incorreto instalado

• O sinal de 530 nm está fora da escala de aquisição

A contagem de células é maior que o esperado

Possíveis causas:

• O volume da microesfera foi entregue de forma insuficiente

• O valor da concentração do grânulo foi inserido incorretamente

• Microesferas foram excluídas do portão

• Os agregados foram excluídos como um evento

• O fator de diluição da amostra estava incorreto

• O portão da cela incluía detritos ou dupletos

A contagem de células está abaixo do esperado

Possíveis causas:

• Volume excessivo de microesferas

• Valor de esferas/mL incorretamente alto

• Perda de células durante a lavagem

• Células alvo excluídas do portão

• Agregados de células contados como eventos únicos

• Volume de amostra original incorreto

• Degradação da amostra

Os resultados variam entre réplicas

Possíveis causas:

• Assentamento de microesferas

• Mistura inconsistente

• Variação de pipetagem

• Diferentes atrasos de aquisição

• Contagens baixas de eventos

• Movimento do portão

• Taxa de fluxo variável

• Heterogeneidade da amostra

Contas Double-Fluo versus outros métodos de contagem

As microesferas Double-Fluo são particularmente úteis quando os usuários necessitam de um padrão de contagem adicionado internamente com dois canais de identificação de fluorescência.

Controle de qualidade para produção em lote

As microesferas de contagem absoluta requerem controle de qualidade do material e controle metrológico.

Os parâmetros de lançamento recomendados incluem:

Propriedades Físicas

• Tamanho médio de partícula

• Distribuição de tamanho de partícula

• Coeficiente de variação

• Morfologia das partículas

• Porcentagem agregada

• Densidade, quando relevante

• Aparência

• Desempenho de redispersão

Propriedades de fluorescência

• Resposta de excitação de 488 nm

• Intensidade de emissão de 530 nm

• Resposta de excitação de 633 nm

• Intensidade de emissão de 670 nm

• Porcentagem dupla positiva

• CV de fluorescência verde

• CV de fluorescência vermelha distante

• Razão de intensidade verde para vermelho distante

• Fotoestabilidade

• Estabilidade de armazenamento

Propriedades de concentração

• Conteúdo de sólidos

• Grânulos analisados/mL

• Tolerância à contagem de partículas

• Variação garrafa a garrafa

• Precisão do volume de enchimento

• Homogeneidade de amostragem

• Estabilidade da concentração atribuída

Propriedades Funcionais

• Separação da porta da microesfera

• Recuperação durante a citometria de fluxo

• Concordância com amostras de contagem de referência

• Linearidade entre concentrações celulares

• Precisão dentro da corrida

• Precisão entre corridas

• Reprodutibilidade do operador

• Compatibilidade do instrumento

Inspeção de entrada recomendada

Os fabricantes de reagentes devem considerar testar cada lote recebido para:

1. Aparência

2. Redispersão

3. Tamanho de partícula

4. Nível agregado

5. Fluorescência verde

6. Fluorescência vermelha distante

7. Porcentagem dupla positiva

8. Grânulos/mL

9. Recuperação de citometria de fluxo

10. Comparação com um lote de referência qualificado

Estratégia de Lote de Referência

Um lote de referência qualificado deve ser retido para comparação com lotes futuros.

Novos lotes podem ser avaliados usando:

• O mesmo citômetro

• As mesmas configurações do detector

• A mesma amostra

• A mesma pipeta

• O mesmo modelo de aquisição

• O mesmo método de bloqueio

• O mesmo software de cálculo

Documentação em lote

Os documentos disponíveis ou personalizados podem incluir:

• Certificado de Análise

• Especificação do produto

• Ficha de dados de segurança

• Relatório de tamanho de partícula

• Relatório de fluorescência

• Relatório de concentração de esferas

• Dados de estabilidade

• Dados de comparação de lotes

• Notificação de alteração de fabricação

Personalização e fabricação em massa

SHBC oferece suporte ao desenvolvimento de microesferas fluorescentes personalizadas para fabricantes de reagentes de citometria de fluxo.

As possíveis opções de personalização incluem:

• Tamanho de partícula

• Distribuição de tamanho de partícula

• Intensidade de excitação de 488 nm

• Intensidade de emissão de 530 nm

• Intensidade de excitação de 633 nm

• Intensidade de emissão de 670 nm

• Razão de intensidade verde para vermelho distante

• Conteúdo de sólidos

• Grânulos/mL

• Tampão de suspensão

• Sistema surfactante

• Sistema conservante

• Volume do pacote

• Formulação de baixa ligação

• Rotulagem OEM

• Embalagem de marca própria

Fornecimento de desenvolvimento

Pequenas quantidades podem ser fornecidas para:

• Compatibilidade do instrumento

• Desenvolvimento de portas

• Avaliação do painel de anticorpos

• Estudos de pipetagem

• Otimização de concentração

• Triagem de estabilidade

Produção Piloto

Os lotes piloto podem apoiar:

• Transferência de processo

• Validação de preenchimento

• Validação de método

• Comparação entre instrumentos

• Avaliação de embalagens

• Estudos de estabilidade acelerados

Fabricação em massa

A produção em massa pode incluir:

• Reserva de lote

• Critérios de lançamento específicos do cliente

• Concentração personalizada

• Embalagem personalizada

• Planejamento de fornecimento de longo prazo

• Serviços OEM e ODM

• Documentação em lote

Armazenamento e Manuseio

As práticas recomendadas incluem:

• Armazenar entre 2 e 8°C, salvo indicação em contrário no rótulo do produto ou no COA.

• Proteja o produto da luz direta.

• Não congele a menos que a estabilidade do congelamento-descongelamento tenha sido validada.

• Misture bem antes de usar.

• Evite a contaminação da suspensão stock.

• Use pipetas calibradas.

• Utilize tubos e ponteiras limpos e de baixa aderência.

• Evite exposição prolongada a temperaturas elevadas.

• Feche o frasco imediatamente após o uso.

• Siga a data de validade específica do lote.

Os produtos comerciais com contas de contagem são normalmente armazenados entre 2 e 8°C e protegidos da luz.

Antes de usar:

1. Inspecione a suspensão.

2. Confirme que as microesferas sedimentadas podem ser redispersas.

3. Misture de acordo com o procedimento validado.

4. Evite introduzir espuma.

5. Pipete imediatamente após a mistura.

6. Retorne a garrafa às condições de armazenamento recomendadas.

Perguntas frequentes

O que são microesferas de contagem absoluta Double-Fluo?

São microesferas de referência fluorescentes projetadas para enumeração absoluta de células por citometria de fluxo.

As microesferas fornecem respostas de fluorescência perto de 530 nm e 670 nm sob excitação de aproximadamente 488 nm e 633 nm.

Qual é o conteúdo de sólidos?

O produto possui teor de sólidos de 0,5%.

Isto corresponde a aproximadamente 5 mg de material de microesferas por mililitro quando expresso como peso por volume.

0,5% de sólidos pode ser usado diretamente na fórmula de contagem?

Não.

A fórmula de contagem absoluta requer a concentração do número de partículas específico do lote em esferas/mL ou esferas/μL.

O conteúdo de sólidos por si só é insuficiente.

Por que o produto precisa de um valor de esferas/mL específico para o lote?

A concentração celular calculada é diretamente proporcional à concentração de microesferas atribuída.

Qualquer erro em esferas/mL produz um erro correspondente no resultado da contagem de células.

Quais lasers são necessários?

Os comprimentos de onda de excitação nominais são 488 nm e 633 nm.

Citômetros de fluxo usando laser vermelho de 635 nm ou 640 nm também podem ser avaliados.

Quais canais de fluorescência são usados?

Os canais de emissão nominais são de aproximadamente 530 nm e 670 nm.

Os filtros exatos do detector devem corresponder aos espectros de fluorescência reais.

As microesferas podem ser detectadas usando apenas um canal?

Potencialmente sim.

No entanto, o uso de ambos os canais de fluorescência pode melhorar a identificação de microesferas e a confiança no controle.

O método deve ser validado com o painel de anticorpos pretendido.

As microesferas Double-Fluo podem ser usadas com anticorpos conjugados com FITC ou APC?

Eles podem se sobrepor a conjugados de anticorpos emissores de verde ou vermelho extremo.

A compatibilidade do painel, a compensação e a separação da porta devem ser avaliadas antes do uso.

As microesferas podem ser usadas com sangue total?

Eles podem ser avaliados com fluxos de trabalho de sangue total e lise sem lavagem.

O reagente de lise, o painel de anticorpos, o volume da amostra e o citômetro devem ser validados.

Eles podem ser usados ​​com células cultivadas?

Sim. Eles podem ser avaliados para enumeração absoluta de células cultivadas, células imunes e outras suspensões de partículas.

Quantos eventos de contas devem ser coletados?

Um mínimo de aproximadamente 1.000 eventos de esferas podem ser usados ​​como alvo inicial durante o desenvolvimento do método.

O requisito final deve basear-se na precisão exigida e na concentração esperada da amostra.

Por que não consigo ver as microesferas no FSC e no SSC?

O limite de dispersão pode ser demasiado elevado ou as microesferas podem ter uma dispersão inferior às células alvo.

Reduza cuidadosamente o limiar e utilize os canais de fluorescência para identificar a população de microesferas.

Por que as microesferas assentam?

As microesferas têm uma densidade diferente da do meio de suspensão e podem sedimentar gradualmente durante o armazenamento.

Misture bem antes de cada alíquota.

O tamanho da partícula pode ser personalizado?

A personalização do tamanho das partículas pode estar disponível de acordo com a quantidade do projeto e requisitos técnicos.

A intensidade da fluorescência pode ser personalizada?

A intensidade verde, a intensidade vermelha distante e a relação entre os dois canais podem ser discutidas para projetos OEM.

O conteúdo de sólidos pode ser personalizado?

Sim. Diferentes conteúdos de sólidos podem estar disponíveis dependendo da quantidade de produção e dos requisitos do projeto.

O fornecimento em massa está disponível?

Sim. SHBC oferece suporte para avaliação de quantidades, lotes piloto, fabricação a granel, reserva de lotes e embalagens personalizadas.

Este é um reagente de diagnóstico acabado?

Não.

As microesferas são fornecidas para uso em pesquisa e desenvolvimento de reagentes. Eles não são um produto de diagnóstico acabado, a menos que sejam validados e registrados separadamente pelo cliente.

Solicite uma amostra ou cotação em massa

A SHBC fornece microesferas fluorescentes de contagem absoluta de citometria de fluxo duplo para enumeração de células imunológicas, pesquisa de imunofenotipagem, desenvolvimento de método de citômetro de fluxo e fabricação de reagentes em lote.

Para solicitar uma amostra, consulta técnica ou orçamento em massa, forneça:

• Aplicação pretendida

• População de células alvo

• Tipo de amostra

• Modelo de citômetro de fluxo

• Comprimentos de onda de laser disponíveis

• Configuração do filtro do detector

• Painel de anticorpos

• Tamanho de partícula necessário

• Grânulos necessários/mL

• Conteúdo de sólidos necessário

• Tamanho de pacote necessário

• Demanda anual esperada

• Requisitos especiais de controle de qualidade

Entre em contato com a SHBC para avaliar microesferas Double-Fluo para seu projeto de contagem absoluta de células, monitoramento imunológico, citometria de fluxo ou desenvolvimento de reagentes OEM.