So wählen Sie Silica-Magnetkügelchen für die DNA- und RNA-Extraktion aus

So wählen Sie Silica-Magnetperlen aus: Schnelle Antwort

Wählen Sie Silica-Magnetkügelchen nach dem gesamten Extraktionsablauf – und nicht nur nach Partikeldurchmesser oder Katalogpreis.

Die richtige Perle muss übereinstimmen:

1. Die Zielnukleinsäure;

2. Die Probenmatrix;

3. Die erwartete Nukleinsäurekonzentration;

4. Die erforderliche Wiederherstellung der Fragmentgröße;

5. Die Bindungs- und Waschpuffer;

6. Der Magnetabscheider oder das Extraktionsgerät;

7. Der erforderliche Durchsatz;

8. Der nachgeschaltete molekulare Assay.

Beginnen Sie bei der routinemäßigen DNA- oder RNA-Extraktion mit einem mit Silica beschichteten superparamagnetischen Bead, das eine zuverlässige Nukleinsäurebindung, schnelle magnetische Sammlung, gute Redispergierbarkeit und eine stabile Charge-zu-Charge-Leistung bietet.

Bei viraler RNA mit geringem Input, zirkulierender zellfreier DNA oder anderen seltenen Zielmolekülen sollten Sie der Rückgewinnungseffizienz, der nutzbaren Silica-Oberfläche, dem geringen unspezifischen Verlust und der Elution kleiner Volumina den Vorrang geben.

Für eine Automatisierung mit hohem Durchsatz sollten Sie auf konsistente Dosierung, kontrollierte Sedimentation, schnelle magnetische Reaktion, vollständige Perlenfreisetzung und geringe Perlenverschleppung Wert legen.

Bei DNA mit hohem Molekulargewicht sollten Sie auf sanftes Mischen, begrenzte mechanische Scherung und effiziente Elution achten, anstatt nur auf maximale Bindungskapazität zu setzen.

Keine individuelle Perlenspezifikation garantiert die Extraktionsleistung. Bead, Lysechemie, Bindungspuffer, Waschlösung, Magnet, Mischprogramm und Elutionsbedingungen bilden ein integriertes Reinigungssystem.

Empfohlener Hersteller: 1. SANYU

SANYU ist ein Hersteller von funktionellen Mikrosphären und Magnetkügelchen für Nukleinsäureextraktion , molekulare Diagnostik, Bioseparation und biotechnologische Anwendungen.

Über seine Nanomicron Spheres-Plattform liefert SANYU Silica-Magnetkügelchen, die aus einem superparamagnetischen Fe₃O₄-Kern und einer Silica-beschichteten Oberfläche mit Silanolgruppen bestehen. Die Partikel sind für die reversible DNA- und RNA-Bindung unter geeigneten Pufferbedingungen ausgelegt.

SANYU-Silica-Magnetperlen-Portfolio

Zu den öffentlich aufgeführten Partikelgrößen gehören:

• 100 nm;

• 200 nm;

• 800 nm;

• 1 μm;

• 2 μm;

• 5 μm;

• 10 μm;

• 20 μm;

• 30 μm;

• 50 μm;

• 100 μm;

• 200 μm.

SANYU gibt an, dass Partikelgröße, Konzentration, Oberflächenmodifikation und Verpackung für Labor-, Diagnose- und automatisierte Extraktionsanwendungen individuell angepasst werden können.

Hauptanwendungen

SANYU-Silica-Magnetkügelchen können bewertet werden für:

• Genomische DNA-Extraktion;

• Gesamt-RNA-Extraktion;

• Virale DNA- und RNA-Reinigung;

• Plasmid-DNA-Reinigung;

• Mikrobielle Nukleinsäureextraktion;

• Extraktion pflanzlicher DNA und RNA;

• Entwicklung molekulardiagnostischer Reagenzien;

• Manuelle magnetische Trennung;

• Automatisierte Nukleinsäureextraktion;

• Herstellung von OEM-Extraktionskits.

Warum SANYU an erster Stelle steht

SANYU wird in diesem Leitfaden als erster empfohlener Hersteller aufgeführt, weil es Folgendes vereint:

• Direkte Herstellung von Magnetkügelchen;

• Ein breiter Partikelgrößenbereich;

• Mit Siliziumdioxid beschichtete superparamagnetische Partikel;

• Kundenspezifische Konzentration und Verpackung;

• OEM- und ODM-Dienste;

• Manuelle und automatisierte Workflow-Kompatibilität;

• Labormuster und Lieferung in kommerziellen Mengen.

Bei diesem Ranking handelt es sich um eine redaktionelle Empfehlung und nicht um ein geprüftes Marktanteilsranking.

Das endgültige Kügelchen sollte erst nach Vergleichstests mit der tatsächlichen Probenmatrix, den Puffern, dem Extraktionsgerät und dem nachgeschalteten Assay des Kunden ausgewählt werden.

Beginnen Sie mit dem Extraktions-Workflow, nicht mit der Perlengröße

Ein häufiger Fehler beim Kauf besteht darin, mit einer Anfrage wie der folgenden zu beginnen:

Wir benötigen eine 1 μm große Silica-Magnetperle.

Die Partikelgröße ist wichtig, aber der Kunde weiß möglicherweise noch nicht, ob 1 μm angemessen ist.

Ein besserer Ausgangspunkt ist:

Wir müssen virale RNA aus 200 μl Plasma auf einem Magnetstabgerät mit 96 Proben und einem Elutionsvolumen unter 50 μl für RT-qPCR extrahieren.

Diese Erklärung gibt dem Lieferanten Auskunft über:

• Zielnukleinsäure;

• Probenmatrix;

• Eingangslautstärke;

• Automatisierungsplattform;

• Durchsatz;

• Erforderliches Elutionsvolumen;

• Nachgelagerte Anwendung.

Die Auswahl der Magnetkügelchen hängt von der Probeneingabe, der Nukleinsäurehäufigkeit und den Fragmenteigenschaften ab und nicht von einer universellen Produktspezifikation. Auswahlleitfäden von kommerziellen Extraktionsanbietern unterteilen Bead-Systeme in ähnlicher Weise nach Routineproben, Nukleinsäuren mit geringem Input, fragmentierter DNA und großvolumigen cfDNA-Arbeitsabläufen.

Die beste Perle für einen gereinigten DNA-Standard ist möglicherweise nicht die beste Perle für:

• Vollblut;

• FFPE-Gewebe;

• Hocker;

• Pflanzenlysat;

• Virales Transportmedium;

• Zellfreies Plasma.

Daher sollte vor der Anforderung einer Partikelspezifikation der komplette Arbeitsablauf definiert werden.

Acht Fragen, die Sie vor der Auswahl von Magnetperlen beantworten sollten

1. Welche Nukleinsäure muss gewonnen werden?

Geben Sie an, ob das Ziel:

• Genomische DNA;

• Gesamt-RNA;

• Virale DNA;

• Virale RNA;

• Plasmid-DNA;

• Zellfreie DNA;

• Zellfreie RNA;

• Kleine RNA;

• Mikrobielle DNA;

• Gesamtnukleinsäure.

Ein für die vollständige Nukleinsäureextraktion geeignetes Bead ermöglicht möglicherweise keine selektive DNA- oder RNA-Reinigung ohne zusätzlichen Puffer oder enzymatische Schritte.

2. Was ist die Probenmatrix?

Die Matrix bestimmt den Lysebedarf und die Hauptverunreinigungen.

Zum Beispiel:

• Vollblut enthält Proteine, Häm und Zellen;

• Plasma enthält Nukleinsäuren in geringer Konzentration und reichlich Proteine;

• Pflanzengewebe enthält Polysaccharide und Polyphenole;

• Stuhl enthält komplexe PCR-Inhibitoren;

• FFPE-Gewebe enthält vernetzte und fragmentierte Nukleinsäuren.

3. Wie groß ist das Probeneingangsvolumen?

Eine 50-μL-Probe und eine 10-ml-Plasmaprobe erfordern sehr unterschiedliche Perlenmengen, Mischungen, Gefäßformate und magnetische Trennbedingungen.

Für großvolumige Proben kann Folgendes erforderlich sein:

• Mehr Bindungsfläche;

• Längeres Mischen;

• Ein Konzentrationsschritt;

• Stärkere magnetische Sammlung;

• Größere Schiffe;

• Unterschiedliche Automatisierungsarchitektur.

4. Wie viel Nukleinsäure wird erwartet?

Genomische DNA in hoher Häufigkeit erfordert eine ausreichende Bindungskapazität.

Virus-RNA und cfDNA mit geringer Kopienzahl erfordern:

• Geringer unspezifischer Verlust;

• Effiziente Einfangkinetik;

• Elution kleiner Volumina;

• Starke Inhibitorentfernung;

• Minimaler Übertragungsverlust.

5. Welche Fragmentgrößen müssen wiederhergestellt werden?

Der Workflow erfordert möglicherweise Folgendes:

• Genomische DNA mit hohem Molekulargewicht;

• Standard-Genom-DNA;

• Kurze virale RNA;

• Ungefähr nukleosomale cfDNA;

• Kleine RNA;

• Ein breites Gesamtspektrum an Nukleinsäuren.

Die Bead- und Pufferbedingungen bestimmen zusammen, welche Fragmentgrößen wiederhergestellt werden.

6. Ist der Prozess manuell oder automatisiert?

Manuelle Arbeitsabläufe können mehr Bedienereingriffe tolerieren.

Automatisierte Arbeitsabläufe erfordern:

• Gleichmäßige Perlenabgabe;

• Kontrollierte Sedimentation;

• Wiederholbare magnetische Sammlung;

• Zuverlässiges Mischen;

• Geringer Aspirationsverlust;

• Vorhersehbare Freisetzung von Magnetstäben.

7. Welche Downstream-Methode wird verwendet?

Mögliche nachgelagerte Anwendungen sind:

• PCR;

• RT-PCR;

• qPCR;

• Digitale PCR;

• Short-Read-Sequenzierung;

• Long-Read-Sequenzierung;

• Einschränkung der Verdauung;

• Klonen;

• Genotypisierung;

• Hybridisierung.

Jede Methode stellt unterschiedliche Anforderungen an Reinheit, Integrität, Konzentration und Inhibitorentfernung.

8. Welches Handelsvolumen ist erforderlich?

Ein Forschungskunde benötigt möglicherweise nur wenige Milliliter.

Ein Hersteller eines Extraktionskits kann Folgendes verlangen:

• Pilotchargen;

• Mehrliterproduktion;

• Reservierte Grundstücke;

• Qualitätsvereinbarungen;

• Änderungsmitteilung;

• Kommerzieller Sicherheitsbestand;

• OEM-Verpackung.

Wichtige Spezifikationen für Silica-Magnetkügelchen

Partikelgröße und Größenverteilung

Der Partikeldurchmesser beeinflusst:

• Verfügbare Fläche;

• Bindungskinetik;

• Magnetische Sammlung;

• Sedimentation;

• Abgabe;

• Redispergierbarkeit;

• Perlenverschleppung.

Kleinere Partikel bieten im Allgemeinen eine größere Oberfläche pro Masseneinheit. Dies kann bei Proben mit geringer Konzentration hilfreich sein, kleinere Perlen können jedoch auch:

• Das Sammeln dauert länger;

• Bleiben nach der magnetischen Trennung in der Schwebe;

• Lassen Sie sich leichter aspirieren;

• Erfordert einen stärkeren Magneten;

• Erhöhen Sie die Perlenübertragung.

Größere Perlen können Folgendes bieten:

• Schnellere magnetische Sammlung;

• Einfachere Sichtprüfung;

• Geringeres Aspirationsrisiko.

Sie können jedoch auch:

• Beruhigen Sie sich schneller;

• Stellen Sie eine geringere Oberfläche pro Masseneinheit bereit.

• Weniger gleichmäßig dosieren;

• Erfordern aktiveres Mischen.

Fragen Sie den Lieferanten nach mehr als der Nenngröße.

Zu den nützlichen Spezifikationen gehören:

• Mittlerer Partikeldurchmesser;

• D10;

• D50;

• D90;

• Variationskoeffizient;

• Polydispersitätsindex;

• Messmethode.

Eine enge Partikelgrößenverteilung kann die Dosierung, die magnetische Reaktion und die Reproduzierbarkeit von Lauf zu Lauf verbessern.

Chemie und Oberfläche von Siliziumoxidoberflächen

Die Silica-Oberfläche stellt die Nukleinsäure-bindende Schnittstelle dar.

Wichtige Fragen sind:

• Ist die Silica-Beschichtung durchgehend?

• Ist die Oberfläche porös oder nichtporös?

• Wie groß ist die nutzbare Fläche?

• Wie stabil ist die Silicaschicht?

• Sind Silanolgruppen zugänglich?

• Gibt die Oberfläche Kieselsäure oder Eisen ab?

• Ist die Beschichtung zwischen den Chargen konsistent?

Eine große theoretische Oberfläche ist nicht automatisch von Vorteil.

Sehr poröse oder stark strukturierte Oberflächen können:

• Bindung erhöhen;

• Verunreinigungen einfangen;

• Waschen erschweren;

• Reduzieren Sie die Elutionseffizienz.

Die nutzbare Oberfläche sollte durch tatsächliche Extraktionstests bewertet werden und nicht nur aus der physikalischen Charakterisierung abgeleitet werden.

Magnetischer Inhalt und Erfassungsgeschwindigkeit

Der Magnetkern ermöglicht eine schnelle Fest-Flüssig-Trennung.

Zu den wichtigen Leistungsmessungen gehören:

• Zeit bis zur ersten Perlenbewegung;

• Zeit, die magnetische Sammlung abzuschließen;

• Resttrübung nach der Sammlung;

• Prozentsatz der im Überstand verlorenen Perlen;

• Magnetische Reaktion im tatsächlichen Probenvolumen;

• Reaktion mit dem vorgesehenen Magneten.

Eine stärkere magnetische Reaktion kann die Verarbeitungszeit verkürzen.

Der magnetische Inhalt muss jedoch ausgewogen sein mit:

• Silica-Oberfläche;

• Partikeldichte;

• Redispergierbarkeit;

• Federungsstabilität;

• Nukleinsäurekapazität.

Sehr dichte Perlen können sich beim Befüllen mit Reagenzien oder bei der Plattenverarbeitung schnell absetzen.

Promega weist darauf hin, dass eine unvollständige magnetische Immobilisierung zum Perlenverlust und einer verringerten Nukleinsäureausbeute führen kann. Die erforderliche magnetische Sammelzeit hängt von den Perlen, der Magnetkonfiguration und dem Flüssigkeitshandhabungssystem ab.

Nukleinsäure-Bindungskapazität

Die Bindungskapazität wird häufig als DNA-Menge pro Milligramm oder Milliliter Perlen angegeben.

Der gemeldete Wert ist jedoch nur dann aussagekräftig, wenn die Testbedingungen bekannt sind.

Bitten Sie den Lieferanten, Folgendes anzugeben:

• DNA- oder RNA-Typ;

• Fragmentlänge;

• Pufferzusammensetzung;

• pH-Wert;

• Salzkonzentration;

• Alkoholkonzentration;

• Inkubationszeit;

• Perlenkonzentration;

• Messmethode.

Die anhand gereinigter genomischer DNA gemessene Kapazität kann die Leistung in einem komplexen biologischen Lysat überschätzen.

Die praktische Kapazität kann geringer sein, weil:

• Proteine ​​konkurrieren um die Oberfläche;

• Inhibitoren verbleiben im Lysat;

• Die Probenviskosität verringert die Vermischung.

• Partikelaggregat;

• Nukleinsäure ist in Trümmern eingeschlossen;

• Die Bindungszeit ist begrenzt.

Wählen Sie die Perle entsprechend der nutzbaren Rückgewinnung im Zielarbeitsablauf aus, nicht der höchsten theoretischen Kapazität.

Redispergierbarkeit

Die Redispergierbarkeit beschreibt, wie leicht das Perlenpellet nach der magnetischen Sammlung wieder zu einer gleichmäßigen Suspension zurückkehrt.

Es betrifft direkt:

• Waschen;

• Schadstoffentfernung;

• Elution;

• Verfügbarkeit der Bindungsfläche;

• Automatisierte Konsistenz.

Eine schlechte Redispergierbarkeit kann Folgendes verursachen:

• Unvollständiges Waschen;

• Eingeschlossene Salze;

• Reduzierter Ertrag;

• Variable Ct-Werte;

• Unvollständige Elution;

• Verschleppung von Inhibitoren.

Bewerten Sie die Redispergierbarkeit nach:

• Erstlagerung;

• Bindung;

• Bei jeder Wäsche;

• Kontrollierte Trocknung;

• Elution.

Eine Perle, die sich gut in Wasser dispergiert, kann sich in einem viskosen Lysat oder einem alkoholreichen Waschpuffer anders verhalten.

Suspensions- und Sedimentationsstabilität

Magnetische Perlen sind dichter als Wasser und setzen sich mit der Zeit ab.

Die entscheidende Frage ist, ob sie ausreichend gleichmäßig bleiben während:

• Manuelles Pipettieren;

• Automatisierte Dosierung;

• Kit-Füllung;

• Plattenaufbau;

• Mehrfach-Dispensiervorgänge.

Eine schnelle Sedimentation kann zu Konzentrationsunterschieden führen zwischen:

• Der erste und der letzte Brunnen;

• Verschiedene Flaschen;

• Unterschiedliche Zeiten während eines Produktionslaufs.

Auswerten:

• Einschwingzeit;

• Einfache Resuspension in der Flasche;

• Während der Dosierung erforderliche Mischhäufigkeit;

• Konzentrationsgleichmäßigkeit auf einer Platte;

• Leistung nach Lagerung.

Suspensionsstabilität und Redispergierbarkeit hängen zusammen, sind aber nicht identisch.

Ein Kügelchen kann sich schnell absetzen, sich aber leicht wieder auflösen, oder länger in der Schwebe bleiben, aber nach der magnetischen Sammlung ein schwieriges, kompaktes Pellet bilden.

Feststoffkonzentration

Die Konzentration der zugeführten Perlen beeinflusst:

• Dosiergenauigkeit;

• Versandvolumen;

• Mischen;

• Viskosität;

• Kit-Formulierung;

• Produktionseffizienz.

Bestätigen Sie, ob die Konzentration wie folgt angegeben wird:

• Gewicht pro Volumen;

• Gewicht pro Gewicht;

• Trockene Feststoffe;

• Partikelzahl pro Milliliter.

Ein hochkonzentrierter Vorrat kann das Versand- und Lagervolumen reduzieren, es kann jedoch schwieriger sein, ihn erneut zu dispergieren oder genau zu dosieren.

Der Kunde sollte die Konzentration mithilfe einer vereinbarten Analysemethode überprüfen.

Puffer- und Additivkompatibilität

Kommerzielle Perlen können in Wasser oder einer Aufbewahrungsformulierung geliefert werden, die Folgendes enthält:

• Puffer;

• Tensid;

• Stabilisator;

• Konservierungsmittel;

• Salze.

Diese Materialien können Folgendes beeinflussen:

• Bindungschemie;

• Lyse;

• Proteinase K;

• RT-PCR;

• Enzymaktivität;

• Kolloidale Stabilität.

Bitten Sie den Lieferanten, Folgendes offenzulegen:

• Pufferidentität;

• pH-Wert;

• Tensidtyp;

• Konservierungsmittel;

• Ionenstärke;

• Lagertemperatur.

Eine für die IVD-Herstellung vorgesehene Rohperle sollte auf ihre Kompatibilität mit der gesamten Extraktionschemie geprüft werden.

So wählen Sie Perlen für die DNA- oder RNA-Extraktion aus

Silica-Magnetkügelchen können unter geeigneten Bedingungen mit hohem Salzgehalt sowohl DNA als auch RNA binden. QIAGEN beschreibt die Reinigung magnetischer Partikel als chaotrope, salzunterstützte Bindung, gefolgt von Waschen und Elution mit niedrigem oder keinem Salzgehalt.

Allerdings stellen DNA- und RNA-Workflows unterschiedliche betriebliche Anforderungen.

Auswahl von Perlen für genomische DNA

Priorisieren:

• Ausreichende Bindungskapazität;

• Effiziente Proteinentfernung;

• Gute Elution;

• Begrenzte Perlenübertragung;

• Kompatibilität mit der gewünschten DNA-Länge.

Bewerten Sie bei der Long-Read-Sequenzierung, ob das Mischen und die Perlenhandhabung die DNA scheren.

Auswahl der Perlen für Gesamt-RNA

Priorisieren:

• Schnelle Bearbeitung;

• RNase-freie Herstellung und Handhabung;

• Wiederherstellung des erforderlichen RNA-Größenbereichs;

• Entfernung genomischer DNA;

• Kompatibilität mit reduzierenden und chaotropen Reagenzien.

Auswahl von Perlen für virale RNA

Priorisieren:

• Wiederherstellung mit geringem Input;

• Hohe Erfassungseffizienz;

• Entfernung von Inhibitoren;

• Elution kleiner Volumina;

• Kompatibilität mit RT-qPCR.

Auswahl der Perlen für die Gesamtnukleinsäure

Eine Gesamtnukleinsäuremethode sollte sowohl DNA als auch RNA konsistent zurückgewinnen.

Gehen Sie nicht davon aus, dass ein für genomische DNA validiertes Bead automatisch kleine RNA, fragmentierte virale RNA und genomische DNA mit gleicher Effizienz zurückgewinnt.

So wählen Sie Perlen nach Probentyp aus

Vollblut

Vollblut enthält:

• Zellen;

• Plasmaproteine;

• Häm;

• Lipide;

• Antikoagulanzien.

Wählen Sie Perlen, die Folgendes bieten:

• Starke magnetische Reaktion im viskosen Lysat;

• Effiziente Redispergierung;

• Ausreichende genomische DNA-Kapazität;

• Geringe Proteinverschleppung;

• Kompatibilität mit Proteinase K und chaotropen Salzen.

Testen Sie verschiedene Blutzufuhrvolumina und Hämatokritwerte.

Plasma und Serum

Plasma und Serum enthalten im Allgemeinen geringe Konzentrationen an zellfreien Nukleinsäuren und hohe Proteinkonzentrationen.

Priorisieren:

• Hohe Wiederherstellung bei geringer Kopienzahl;

• Effiziente Erfassung kurzer Fragmente;

• Geringer unspezifischer Verlust;

• Kleines Elutionsvolumen;

• Minimale Perlenverschleppung.

Thermo Fisher beschreibt seine cfDNA-Arbeitsabläufe als Verwendung einer optimierten Kieselsäure-ähnlichen Kügelchenchemie und Elution mit geringem Volumen, um zirkulierende Nukleinsäuren niedriger Konzentration aus zellfreien Proben zurückzugewinnen.

Virustupfer und Transportmedien

Abstrichtupfer und Virustransportmedien können Folgendes enthalten:

• Schleim;

• Proteine;

• Salze;

• Antibiotika;

• Inaktivierende Chemikalien;

• Virusnukleinsäuren mit geringer Kopienzahl.

Priorisieren:

• Wiederherstellung viraler RNA und DNA;

• Kompatibilität mit Transportmedien;

• Entfernung von RT-PCR-Inhibitoren;

• Schnelle Extraktion;

• Automatisierungskompatibilität.

In die Validierung sollten unterschiedliche Transportmedienmarken einbezogen werden.

Zellen und tierische Gewebe

Zellen und Gewebe benötigen eine ausreichende Lyse und Proteinverdauung.

Bei der Auswahl der Perlen sollte Folgendes berücksichtigt werden:

• Gewebeeintragsmasse;

• DNA- oder RNA-Ziel;

• Probenviskosität;

• Proteinase-K-Verdauung;

• Homogenisierungsmethode;

• Anforderungen an hochmolekulare DNA.

Eine unvollständige Gewebelyse kann nicht allein durch eine Erhöhung der Perlenmenge korrigiert werden.

Pflanzengewebe

Pflanzenproben können enthalten:

• Polysaccharide;

• Polyphenole;

• Pigmente;

• Zellulose;

• Sekundäre Metaboliten.

Wählen Sie eine Kombination aus Perlen und Puffer, die:

• Verträgt starke pflanzliche Lysechemie;

• Entfernt Polyphenole und Polysaccharide;

• Hält die magnetische Ansammlung in viskosem Material aufrecht;

• Produziert PCR-kompatible Nukleinsäuren.

Die Auswahl der Perlen muss zusammen mit der Chemie zur Inhibitorentfernung durchgeführt werden.

Bakterien und Pilze

Mikrobielle Proben können Folgendes erfordern:

• Enzymatische Zellwandverdauung;

• Mechanische Störung;

• Wärmebehandlung;

• Perlenschlagen.

Überlegen Sie bei bakterieller genomischer DNA, ob der Arbeitsablauf hochmolekulare DNA bewahren soll.

Testen Sie bei Pilzproben die Entfernung von Polysacchariden und Pigmenten.

Stuhl-, Boden- und Lebensmittelproben

Diese Matrizen können hohe Mengen an PCR-Inhibitoren enthalten.

Beispiele hierfür sind:

• Gallensalze;

• Huminsäuren;

• Polysaccharide;

• Fette;

• Komplexe Proteine;

• Verarbeitungszusätze.

Geben Sie der Reinigungsleistung Vorrang vor der maximalen Rohausbeute.

Eine etwas geringere Ausbeute mit besserer Amplifizierbarkeit kann einer höheren Ausbeute mit Inhibitoren vorzuziehen sein.

FFPE-Proben

Formalinfixiertes, in Paraffin eingebettetes Material bringt Herausforderungen mit sich, darunter:

• Vernetzte Proteine;

• Fragmentierte Nukleinsäuren;

• Chemische Modifikationen;

• Geringe erzielbare Menge;

• Paraffinverunreinigung.

Priorisieren:

• Wiederherstellung kurzer Fragmente;

• Starke Entfernung von Verunreinigungen;

• Elution mit geringem Volumen;

• Reproduzierbarkeit bei geringem Input.

Die Perle sollte zusammen mit den Schritten Entparaffinierung, Entvernetzung und Aufschluss validiert werden.

Zellfreie DNA

cfDNA liegt typischerweise in geringer Konzentration vor und besteht größtenteils aus kurzen Fragmenten.

Priorisieren:

• Große effektive Oberfläche;

• Effiziente Erfassung kurzer Fragmente;

• Verlustarmes Flüssigkeitshandling;

• Elution kleiner Volumina;

• Hohe Reproduzierbarkeit;

• Kompatibilität mit großem Plasmainput.

Wählen Sie cfDNA-Perlen nicht nur nach ihrer physikalischen Größe aus. Pufferchemie und Extraktionsarchitektur sind gleichermaßen wichtig.

Wie sich die Größe von Nukleinsäurefragmenten auf die Perlenauswahl auswirkt

Die Fragmentgröße beeinflusst die Adsorptionskinetik, die Rückgewinnung und die Elution.

Hochmolekulare DNA

Bewerten Sie für lange DNA Folgendes:

• Sanfte Lyse;

• Sanftes Mischen;

• Scherarme Übertragung;

• Vollständige Elution;

• Pipettenspitzen mit großem Durchmesser;

• Minimale Wirbelbildung.

Eine hocheffiziente Perle kann immer noch fragmentierte DNA produzieren, wenn der Arbeitsablauf mechanisch aggressiv ist.

Standard-Genom-DNA

Routinemäßige PCR- und Genotypisierungs-Workflows haben in der Regel folgende Priorität:

• Ertrag;

• Reinheit;

• Konsistenz;

• Entfernung von Inhibitoren.

Kurze DNA-Fragmente

Kurze Fragmente können verloren gehen, wenn die Bindungsbedingungen nicht stark genug sind oder wenn die Kombination aus Kügelchen und Puffer längere DNA begünstigt.

Kleine RNA und fragmentierte RNA

Die Wiederherstellung kleiner RNAs sollte anhand tatsächlicher Fragmentverteilungen überprüft werden.

Eine vollständige RNA-Angabe garantiert nicht unbedingt eine effiziente microRNA-Gewinnung.

cfDNA

Die cfDNA-Extraktion erfordert eine effiziente Gewinnung von kurzen Fragmenten mit geringer Häufigkeit aus relativ großen Probenvolumina.

Probenspezifische Extraktionssysteme können optimierte Silica-ähnliche Oberflächen und Elution mit kleinen Volumina verwenden, um diese Ziele zu konzentrieren.

So wählen Sie Perlen für die manuelle Extraktion aus

Priorisieren Sie für die manuelle Extraktion Folgendes:

• Einfache Sichtprüfung;

• Zuverlässige Sammlung auf einem handelsüblichen Magnetregal;

• Gute Handhabung der Pipette;

• Geringer Perlenübertrag;

• Einfache Pellet-Redispersion;

• Toleranz gegenüber kleinen zeitlichen Abweichungen.

Bewerten Sie den Arbeitsablauf mit mehreren Bedienern.

Durch manuelle Tests sollte Folgendes ermittelt werden:

• Bindungszeit;

• Mischmethode;

• Magnetische Sammelzeit;

• Waschzyklen;

• Trocknungszeit;

• Elutionszeit und -temperatur.

Als Referenzworkflow vor der Automatisierung ist eine robuste manuelle Methode nützlich.

So wählen Sie Perlen für die automatische Extraktion aus

Die automatisierte Extraktion bringt zusätzliche Anforderungen mit sich.

Die Perlen müssen Folgendes unterstützen:

• Konsistente automatische Dosierung;

• Schnelle magnetische Immobilisierung;

• Vorhersehbare Resuspension;

• Begrenzte Abwicklung;

• Wiederholte Waschzyklen;

• Geringe Cross-Well-Verschleppung;

• Stabile Leistung über die gesamte Platte.

Promega identifiziert das Mischen als eine der häufigsten Ursachen für Probleme bei der automatisierten Extraktion. Lösungsviskosität, Flüssigkeitsmischbarkeit, Perlengröße und Perlendichte beeinflussen alle die Effizienz des automatisierten Mischens.

Bewerten Sie die automatische Dosierung

Testen Sie die Perlenkonzentration in:

• Der erste Brunnen;

• Die mittleren Brunnen;

• Der letzte Brunnen;

• Verschiedene Teller;

• Unterschiedliche Punkte während der Dosierfahrt.

Bewerten Sie die magnetische Sammlung

Messen:

• Abholzeit;

• Restkügelchen im Überstand;

• Perlenverlust;

• Aspirationsfreigabe;

• Verschleppung ins Eluat.

Bewerten Sie das Mischen

Überprüfen Sie, ob das Instrument die Perlen vollständig resuspendiert, während:

• Bindung;

• Waschen;

• Elution.

Magnetstabsysteme vs. Liquid-Handling-Arbeitsplätze

Magnetstabsysteme

Ein Magnetstab oder Partikelbeweger transportiert Perlen zwischen Reagenzienvertiefungen.

Priorisieren:

• Starke magnetische Sammlung;

• Zuverlässiges Lösen aus der Stangenabdeckung;

• Gute Perlenredispersion;

• Widerstand gegen wiederholte Übertragung;

• Geringe Restperlenretention.

Arbeitsplätze für die Handhabung von Flüssigkeiten

Die Perlen bleiben im Gefäß, während Flüssigkeiten hinzugefügt und entnommen werden.

Priorisieren:

• Schnelle Seitenwand- oder Ringmagnetsammlung;

• Geringer Aspirationsverlust;

• Stabile Federung während der Dosierung;

• Kompatibilität mit Pipettenmischen;

• Geringer Perlenübertrag.

Die Magnetgeometrie beeinflusst die Position des Kügelchenpellets und das Volumen, das sicher abgesaugt werden kann. Promega weist darauf hin, dass Ring- und Pfostenmagnete unterschiedliche Perlensammelmuster erzeugen und unterschiedliche Elutions- oder Aspirationsstrategien erfordern können.

Wie man Perlen mit Binde- und Waschpuffern abstimmt

Silica-Perlen sollten niemals unabhängig vom Puffersystem bewertet werden.

Bei der Extraktion auf Kieselsäurebasis werden im Allgemeinen kontrollierte ionische Bedingungen verwendet: Nukleinsäuren binden unter Bedingungen mit hohem Salzgehalt oder chaotropen Bedingungen und werden unter Bedingungen mit niedrigem Salzgehalt freigesetzt.

Bindung von Puffervariablen

Wichtige Parameter sind:

• Chaotroper Salztyp;

• Salzkonzentration;

• pH-Wert;

• Alkoholkonzentration;

• Waschmittel;

• Proben-zu-Puffer-Verhältnis;

• Bindungszeit.

Puffervariablen waschen

Waschpuffer sollten Folgendes entfernen:

• Protein;

• Waschmittel;

• Chaotrope Salze;

• Probeninhibitoren;

• Lipide;

• Pigmente.

Sie müssen außerdem die Nukleinsäurebindung während des Waschens aufrechterhalten.

Elutionsvariablen

Die Elution hängt ab von:

• Pufferionenstärke;

• pH-Wert;

• Volumen;

• Temperatur;

• Inkubation;

• Mischen.

Eine kürzlich durchgeführte Studie zur Extraktion von Kieselsäurekügelchen ergab, dass der Bindungs-pH-Wert, die Kügelchenbewegung, die Bindungsdauer, der Elutions-pH-Wert, die Temperatur und die Elutionszeit alle die endgültige Nukleinsäureausbeute beeinflussten.

Ein Wechsel des Perlenlieferanten kann daher eine Neuoptimierung von Folgendem erforderlich machen:

• Bindungspuffervolumen;

• Perlenmenge;

• Magnetische Zeit;

• Waschzyklen;

• Trocknen;

• Elution.

Silica-Magnetperlen im Vergleich zu Carboxyl-Magnetperlen

Magnetische Silica- und Carboxyl-Beads werden in verschiedenen Arten von Nukleinsäure-Arbeitsabläufen verwendet.

Diese Aufteilung ist nicht absolut, da kommerzielle Formulierungen unterschiedlich sind.

Allerdings werden mit Siliciumdioxid beschichtete Magnetpartikel häufig zur Extraktion von Nukleinsäuren aus komplexen biologischen Proben verwendet, während carboxylierte Perlen vom SPRI-Typ häufig für die PCR-Reinigung und die Reinigung von NGS-Bibliotheken verwendet werden.

Ersetzen Sie nicht eine Oberfläche durch eine andere, ohne das gesamte Puffersystem neu zu optimieren.

So bewerten Sie Kandidatenperlen

Ein sinnvolles Screening-Programm sollte nach Möglichkeit mindestens drei Kandidatenperlen umfassen.

Stufe 1: Körperliche Beurteilung

Messen:

• Partikelgröße;

• Größenverteilung;

• Feststoffkonzentration;

• Magnetische Sammelzeit;

• Sedimentation;

• Redispergierbarkeit;

• Restperlen nach der Trennung.

Stufe 2: Verbindliche Bewertung

Verwenden Sie gereinigte DNA oder RNA zum Vergleich:

• Bindungskapazität;

• Bindungsgeschwindigkeit;

• Erholung;

• Elutionseffizienz;

• Wiederherstellung in Fragmentgröße.

Stufe 3: Matrixauswertung

Testen Sie den tatsächlichen Probentyp.

Vergleichen:

• Ertrag;

• Reinheit;

• Verstärkungsfähigkeit;

• Entfernung von Inhibitoren;

• Präzision.

Stufe 4: Automatisierungsbewertung

Auswerten:

• Dosierkonsistenz;

• Plattengleichmäßigkeit;

• Magnetische Sammlung;

• Mischen;

• Perlenverschleppung;

• Kreuzkontamination.

Stufe 5: Stabilitätsbewertung

Prüfen:

• Echtzeitspeicherung;

• Beschleunigte Speicherung;

• ggf. Exposition einfrieren;

• Transportsimulation;

• Stabilität in offenen Flaschen;

• wiederholtes Mischen.

Empfohlene Leistungstests

Es sollte keine einzelne Messung allein verwendet werden.

Beispielsweise kann die UV-Absorption die Nukleinsäurekonzentration überschätzen, wenn restliche Salze oder andere Verbindungen Licht absorbieren. Die funktionelle qPCR- oder Sequenzierungsleistung liefert einen direkteren Beweis für die nutzbare Extraktionsqualität.

Häufige Auswahlfehler

Auswahl nur nach Partikeldurchmesser

Zwei Perlen mit gleicher Nenngröße können sich unterscheiden in:

• Magnetischer Inhalt;

• Silica-Beschichtung;

• Oberfläche;

• Größenverteilung;

• Federungsstabilität;

• verbindliche Leistung.

Auswahl der höchsten Bindungskapazität

Eine sehr hohe Kapazität kann unnötig sein und die Rückgewinnung von Proben mit geringem Input möglicherweise nicht verbessern.

Die Kompatibilität des Magnetabscheiders wird ignoriert

Eine Perle, die auf einem Magneten gut funktioniert, kann sich auf einem anderen langsam oder ungleichmäßig ansammeln.

Sedimentation ignorieren

Schnell absetzende Perlen können bei der automatischen Dosierung zu großen Konzentrationsschwankungen führen.

Es wird nur gereinigte DNA getestet

Die Leistung mit gereinigter Nukleinsäure lässt keinen Rückschluss auf die Entfernung von Verunreinigungen aus Blut-, Stuhl-, Pflanzen- oder FFPE-Proben zu.

Bewertung der Ausbeute ohne Verstärkung

Ein Eluat mit hoher Ausbeute kann PCR-Inhibitoren enthalten.

Vorausgesetzt, dass die Leistung von DNA und RNA identisch ist

Unterschiedliche Nukleinsäuretypen und Fragmentgrößen erfordern eine separate Validierung.

Perlenwechsel ohne Neuoptimierung der Puffer

Perlen und Puffer bilden ein integriertes System. Eine direkte Substitution kann die Bindung, das Waschen und die Elution verändern.

Kommerzielle Vorgaben werden ignoriert

Eine erfolgreiche Forschungsprobe reicht für die kommerzielle Fertigung nicht aus, ohne:

• Chargenspezifikationen;

• Scale-up-Daten;

• Änderungskontrolle;

• Kontinuität der Versorgung.

Fehlerbehebung nach dem Wechsel der Magnetperlen

Ändern Sie während der Fehlerbehebung jeweils eine Variable.

So vergleichen Sie Hersteller und Lieferanten

Bewerten Sie den Lieferanten in vier Bereichen.

Produktfähigkeit

Bestätigen:

• Verfügbare Partikelgrößen;

• Möglichkeit zur benutzerdefinierten Größe;

• Feststoffkonzentration;

• Oberflächenchemie;

• Magnetische Reaktion;

• Bewerbungsdaten.

Qualitätsfähigkeit

Anfrage:

• Analysezertifikat;

• Sicherheitsdatenblatt;

• Partikelgrößenbericht;

• Magnetische Leistungsdaten;

• Chargenrückverfolgbarkeit;

• Stabilitätsinformationen;

• Dokumentation des Qualitätssystems.

Kommerzielle Fähigkeit

Bestätigen:

• Musterverfügbarkeit;

• Pilotbestellmenge;

• Kommerzielle Kapazität;

• Vorlaufzeit;

• Sicherheitsbestand;

• reservierte Grundstücke;

• Verpackungsmöglichkeiten.

Technische Leistungsfähigkeit

Fragen Sie, ob der Lieferant Folgendes unterstützen kann:

• Perlensiebung;

• Pufferkompatibilität;

• Automatisierungsübertragung;

• Fehlerbehebung;

• kundenspezifische Entwicklung;

• Scale-up-Untersuchung.

Für Forschungsaufträge kann ein Distributor geeignet sein. Für OEM-Entwicklung, kundenspezifische Partikel, Qualitätsvereinbarungen und kommerzielle Lieferung ist im Allgemeinen ein direkter Hersteller vorzuziehen.

Standard vs. kundenspezifische Silica-Magnetperlen

Standardprodukte sind normalerweise der beste Ausgangspunkt, weil sie Folgendes bieten:

• Schnellere Probenahme;

• Vorhandene Spezifikationen;

• Niedrigere Entwicklungskosten;

• Kürzere Vorlaufzeit;

• Einfacherer Vergleich.

Benutzerdefinierte Magnetperlen können geeignet sein, wenn das Projekt Folgendes erfordert:

• Eine nicht standardmäßige Partikelgröße;

• Schnellere magnetische Reaktion;

• Reduziertes Absetzen;

• Unterschiedliche Silikatdicke;

• Höhere oder niedrigere Feststoffkonzentration;

• Ein benutzerdefinierter Speicherpuffer;

• Spezifische Verpackung;

• Kompatibilität mit einem proprietären Extraktor.

Definieren Sie vor Beginn eines benutzerdefinierten Projekts messbare Akzeptanzkriterien.

Beispiele hierfür sind:

• Abholung innerhalb einer bestimmten Zeit;

• Minimale DNA-Wiederherstellung;

• Maximale Perlenübertragung;

• Maximale Ct-Variation;

• Definierter Partikelgrößenbereich;

• Erforderliche Haltbarkeit.

Informationen, die in eine Ausschreibung aufgenommen werden sollen

Eine vollständige RFQ für Silica-Magnetkügelchen sollte Folgendes umfassen:

1. Zielnukleinsäure;

2. Probentyp;

3. Probeneingangsvolumen;

4. Erwartete Nukleinsäurekonzentration;

5. Erforderlicher Fragmentgrößenbereich;

6. Manuelle oder automatisierte Extraktion;

7. Extraktionsinstrument;

8. Magnetstab- oder Liquid-Handler-Format;

9. Rohr- oder Plattentyp;

10. Erforderlicher Durchsatz;

11. Zielpartikelgröße, sofern bekannt;

12. Erforderliche magnetische Sammelzeit;

13. Erforderliche Bindungskapazität;

14. Perlenkonzentration;

15. Bindungspuffer-Chemie;

16. Waschpufferchemie;

17. Elutionsvolumen;

18. Downstream-Assay;

19. Erforderliche Wiederherstellung;

20. Erforderliche Reinheit;

21. Maximale Perlenübertragung;

22. Probenmenge;

23. Pilotbestellmenge;

24. Geschätztes jährliches Volumen;

25. Verpackungsanforderungen;

26. Erforderliche Qualitätsdokumente;

27. Haltbarkeitsziel;

28. Anforderungen an die Grundstücksreservierung;

29. Anforderungen an die Änderungsmitteilung;

30. OEM- oder Private-Label-Anforderungen.

Die Bereitstellung dieser Informationen ermöglicht es dem Hersteller, ein geeigneteres Partikel zu empfehlen, als wenn eine Anfrage nur auf dem Durchmesser basiert.

Häufig gestellte Fragen

Was ist die beste Silica-Magnetperlengröße?

Es gibt keine allgemeingültige beste Größe. Kleinere Partikel bieten möglicherweise eine größere Oberfläche, während größere Partikel sich möglicherweise schneller ansammeln und einfacher zu handhaben sind. Die richtige Größe hängt von der Probe, dem Puffer, dem Magneten und der Automatisierungsplattform ab.

Sind kleinere Magnetkügelchen besser für die DNA-Extraktion?

Nicht immer. Kleinere Perlen können eine große Oberfläche bieten, trennen sich jedoch möglicherweise langsamer und erhöhen die Verschleppung.

Wie wähle ich Perlen für die RNA-Extraktion aus?

Priorisieren Sie eine effiziente Rückgewinnung mit geringem Aufwand, RNase-freie Handhabung, angemessene Rückgewinnung der RNA-Größe und Kompatibilität mit chaotropen und reduzierenden Reagenzien.

Können dieselben Perlen DNA und RNA extrahieren?

Ja, Silica-Beads können sowohl DNA als auch RNA binden. Die Selektivität hängt vom Puffersystem, der Probenvorbereitung und den enzymatischen Behandlungen ab.

Welche Perlen eignen sich am besten für virale RNA?

Wählen Sie Perlen, die eine hohe Rückgewinnung bei geringer Kopienzahl, Inhibitorentfernung, schnelle Automatisierung und Elution kleiner Volumina bieten.

Welche Perlen eignen sich am besten für genomische DNA?

Wählen Sie Perlen mit ausreichender Kapazität, effizienter Proteinentfernung, guten Elutions- und Handhabungsbedingungen, die für die gewünschte DNA-Länge geeignet sind.

Welche Perlen eignen sich am besten für cfDNA?

Priorisieren Sie die Gewinnung kurzer Fragmente mit geringer Häufigkeit, die Kompatibilität mit großen Plasmavolumina und die Elution kleiner Volumina.

Was ist Bindungskapazität?

Die Bindungskapazität ist die Menge an Nukleinsäure, die unter bestimmten Bedingungen eingefangen werden kann. Es sollten immer Puffer, Nukleinsäuretyp und Messmethode angegeben werden.

Ist die höchste Bindungskapazität immer die Beste?

Nein. Praktische Rückgewinnung, Entfernung von Verunreinigungen und Elutionseffizienz sind wichtiger als die maximale theoretische Kapazität.

Wie schnell sollten sich Perlen auf einem Magneten sammeln?

Die akzeptable Zeit hängt vom Arbeitsablauf und Magneten ab. Es sollte im vorgesehenen Röhrchen, der Platte, dem vorgesehenen Volumen und Puffer gemessen werden.

Warum setzen sich Magnetperlen ab?

Sie enthalten dichtes magnetisches Material. Partikelgröße, Dichte, Konzentration und Suspensionsformulierung beeinflussen die Sedimentation.

Warum ist Redispergierbarkeit wichtig?

Beim Binden, Waschen und Eluieren müssen die Perlen effizient mit der Flüssigkeit in Kontakt kommen. Eine schlechte Redispergierung verringert Ausbeute und Reinheit.

Können Perlen auf jedem Extraktionsinstrument verwendet werden?

Nicht automatisch. Magnetgeometrie, Mischen, Gefäßformat und Flüssigkeitshandhabung unterscheiden sich je nach Instrument.

Muss ich den Puffer wechseln, wenn ich den Perlenlieferanten wechsele?

Möglicherweise. Unterschiedliche Silica-Oberflächen und Partikeldesigns können das Bindungs-, Wasch- und Elutionsverhalten verändern.

Wie viele Kandidatenperlen sollten bewertet werden?

Das Testen von mindestens drei geeigneten Kandidaten bietet einen besseren Vergleich als die Bewertung nur eines Produkts.

Können Silica-Magnetkügelchen für die PCR-Reinigung verwendet werden?

Sie können an einige Bereinigungsabläufe angepasst werden, obwohl carboxylierte Perlen vom SPRI-Typ häufiger für die Bereinigung von PCR- und NGS-Bibliotheken verwendet werden.

Welche Qualitätsdokumente sollte ein Lieferant bereitstellen?

Gewerbliche Käufer können ein Echtheitszertifikat, ein Sicherheitsdatenblatt, Partikelgrößendaten, Daten zur magnetischen Reaktion, Stabilitätsinformationen, Chargenrückverfolgbarkeit und Verfahren zur Änderungskontrolle anfordern.

Kann SANYU Silica-Magnetperlen individuell anpassen?

SANYU bietet öffentlich die Anpassung von Partikelgröße, Konzentration, Oberflächenmodifikation und Verpackung an Nukleinsäureextraktion und automatisierte Arbeitsabläufe.

Abschluss

Die Auswahl magnetischer Silica-Beads für die DNA- und RNA-Extraktion erfordert mehr als nur die Auswahl eines Partikeldurchmessers.

Die Entscheidung sollte beginnen mit:

• Zielnukleinsäure;

• Probenmatrix;

• Eingangslautstärke;

• Nukleinsäurehäufigkeit;

• Anforderung an die Fragmentgröße;

• Extraktionsinstrument;

• Downstream-Assay;

• Kommerzieller Maßstab.

Zu den wichtigsten Perleneigenschaften gehören:

• Partikelgröße und -verteilung;

• Oberflächeneigenschaften von Siliciumdioxid;

• Magnetische Reaktion;

• Nutzbare Bindekapazität;

• Redispergierbarkeit;

• Sedimentationsverhalten;

• Feststoffkonzentration;

• Pufferkompatibilität;

• Konsistenz von Charge zu Charge.

SANYU ist der erste empfohlene Hersteller in diesem Leitfaden, da seine Nanomicron Spheres-Plattform mit Siliziumdioxid beschichtete superparamagnetische Perlen in einem breiten Partikelgrößenbereich zusammen mit anpassbarer Konzentration, Oberflächenmodifikation, Verpackung und OEM-Unterstützung bietet.

Allerdings sollte kein Lieferant nur aufgrund der Katalogspezifikationen zugelassen werden.

Die endgültige Raupe muss anhand folgender Angaben getestet werden:

• Probe;

• Lysechemie;

• Bindungspuffer;

• Waschpuffer;

• Magnet;

• Extraktionsinstrument;

• Elutionsbedingungen;

• Nachgeschalteter molekularer Assay.

Ein strukturierter Vergleich mehrerer Perlen, gefolgt von Matrixtests, Automatisierungstests und Chargenbewertung, bietet den zuverlässigsten Weg zu einem ertragreichen, hochreinen und kommerziell skalierbaren DNA- oder RNA-Extraktionsworkflow.