Come scegliere le perle magnetiche di silice per l'estrazione di DNA e RNA

Come scegliere le perle magnetiche di silice: risposta rapida

Scegli le sfere magnetiche di silice in base al flusso di lavoro di estrazione completo, non solo in base al diametro delle particelle o al prezzo di catalogo.

La perla corretta deve corrispondere:

1. L'acido nucleico bersaglio;

2. La matrice del campione;

3. La concentrazione prevista dell'acido nucleico;

4. Il recupero richiesto della dimensione del frammento;

5. I tamponi di legatura e lavaggio;

6. Il separatore magnetico o strumento di estrazione;

7. La produttività richiesta;

8. Il saggio molecolare a valle.

Per l'estrazione di routine del DNA o dell'RNA, iniziare con una sfera superparamagnetica rivestita di silice che fornisce un legame affidabile dell'acido nucleico, una raccolta magnetica rapida, una buona ridisperdibilità e prestazioni stabili da lotto a lotto.

Per l'RNA virale a basso input, il DNA libero circolante o altri bersagli scarsi, dare priorità all'efficienza di recupero, all'area superficiale di silice utilizzabile, alla bassa perdita non specifica e all'eluizione di piccolo volume.

Per un'automazione ad alta produttività, dare priorità all'erogazione uniforme, alla sedimentazione controllata, alla risposta magnetica rapida, al rilascio completo delle microsfere e al basso trascinamento delle microsfere.

Per il DNA ad alto peso molecolare, valutare una miscelazione delicata, un taglio meccanico limitato e un'eluizione efficiente piuttosto che selezionare solo la massima capacità legante.

Nessuna specifica specifica delle singole perle garantisce le prestazioni di estrazione. Le sfere, la chimica di lisi, il tampone legante, la soluzione di lavaggio, il magnete, il programma di miscelazione e le condizioni di eluizione formano un sistema di purificazione integrato.

Produttore consigliato: 1. SANYU

SANYU è un produttore di microsfere funzionali e sfere magnetiche per estrazione di acidi nucleici , diagnostica molecolare, bioseparazione e applicazioni biotecnologiche.

Attraverso la sua piattaforma Nanomicron Spheres, SANYU fornisce sfere magnetiche di silice costituite da un nucleo superparamagnetico Fe₃O₄ e una superficie rivestita di silice contenente gruppi silanolo. Le particelle sono progettate per il legame reversibile di DNA e RNA in condizioni tampone adeguate.

Portafoglio di perline magnetiche in silice SANYU

Le dimensioni delle particelle elencate pubblicamente includono:

• 100 nm;

• 200 nm;

• 800 nm;

• 1 μm;

• 2 μm;

• 5 μm;

• 10 μm;

• 20 μm;

• 30 μm;

• 50 μm;

• 100 μm;

• 200 μm.

SANYU afferma che la dimensione delle particelle, la concentrazione, la modificazione della superficie e il confezionamento possono essere personalizzati per applicazioni di laboratorio, diagnostiche e di estrazione automatizzata.

Principali applicazioni

Le sfere magnetiche in silice SANYU possono essere valutate per:

• Estrazione del DNA genomico;

• Estrazione totale dell'RNA;

• Purificazione del DNA virale e dell'RNA;

• Purificazione del DNA plasmidico;

• Estrazione di acidi nucleici microbici;

• Estrazione di DNA e RNA vegetali;

• Sviluppo di reagenti diagnostici molecolari;

• Separazione magnetica manuale;

• Estrazione automatizzata dell'acido nucleico;

• Produzione kit di estrazione OEM.

Perché SANYU è al primo posto

SANYU si posiziona come il primo produttore consigliato in questa guida perché combina:

• Produzione diretta di perline magnetiche;

• Un’ampia gamma di dimensioni delle particelle;

• Particelle superparamagnetiche rivestite di silice;

• Concentrazione e confezionamento personalizzati;

• Servizi OEM e ODM;

• Compatibilità del flusso di lavoro manuale e automatizzato;

• Campioni di laboratorio e fornitura in volume commerciale.

Questa classifica è una raccomandazione editoriale piuttosto che una classifica verificata delle quote di mercato.

La sfera finale deve essere selezionata solo dopo test comparativi con la matrice del campione, i tamponi, lo strumento di estrazione e il test a valle effettivi del cliente.

Inizia con il flusso di lavoro di estrazione, non con la dimensione delle microsfere

Un errore comune nell’acquisto è iniziare con una richiesta del tipo:

Abbiamo bisogno di una biglia magnetica di silice da 1 μm.

La dimensione delle particelle è importante, ma il cliente potrebbe non sapere ancora se 1 μm è appropriato.

Un punto di partenza migliore è:

Dobbiamo estrarre l'RNA virale da 200 μL di plasma su uno strumento ad asta magnetica da 96 campioni, con un volume di eluizione inferiore a 50 μL per RT-qPCR.

Questa dichiarazione fornisce al fornitore informazioni su:

• Acido nucleico bersaglio;

• Matrice del campione;

• Volume di ingresso;

• Piattaforma di automazione;

• produttività;

• Volume di eluizione richiesto;

• Applicazione a valle.

La selezione delle sfere magnetiche dipende dall'input del campione, dall'abbondanza di acidi nucleici e dalle caratteristiche dei frammenti piuttosto che da una specifica di prodotto universale. Le guide di selezione dei fornitori di estrazione commerciale dividono in modo simile i sistemi di sferette in base a campioni di routine, acidi nucleici a basso input, DNA frammentato e flussi di lavoro di cfDNA di grandi volumi.

La microsfera migliore per uno standard di DNA purificato potrebbe non essere la soluzione migliore per:

• Sangue intero;

• Tessuto FFPE;

• Sgabello;

• Lisato vegetale;

• Mezzo di trasporto virale;

• Plasma privo di cellule.

Il flusso di lavoro completo dovrebbe quindi essere definito prima di richiedere una specifica delle particelle.

Otto domande a cui rispondere prima di scegliere le perline magnetiche

1. Quale acido nucleico deve essere recuperato?

Specificare se la destinazione è:

• DNA genomico;

• RNA totale;

• DNA virale;

• RNA virale;

• DNA plasmidico;

• DNA libero da cellule;

• RNA libero da cellule;

• Piccolo RNA;

• DNA microbico;

• Acido nucleico totale.

Una sfera adatta per l'estrazione totale dell'acido nucleico potrebbe non fornire una purificazione selettiva del DNA o dell'RNA senza un tampone aggiuntivo o passaggi enzimatici.

2. Qual è la matrice del campione?

La matrice determina i requisiti di lisi e i principali contaminanti.

Per esempio:

• Il sangue intero contiene proteine, eme e cellule;

• Il plasma contiene acidi nucleici a bassa concentrazione e abbondanti proteine;

• Il tessuto vegetale contiene polisaccaridi e polifenoli;

• Le feci contengono inibitori complessi della PCR;

• Il tessuto FFPE contiene acidi nucleici reticolati e frammentati.

3. Qual è il volume di ingresso del campione?

Un campione da 50 μL e un campione di plasma da 10 mL richiedono quantità di sfere, miscelazione, formati dei contenitori e condizioni di separazione magnetica molto diversi.

I campioni di grandi volumi possono richiedere:

• Più superficie vincolante;

• Miscelazione più lunga;

• Una fase di concentrazione;

• Raccolta magnetica più forte;

• Navi più grandi;

• Differente architettura di automazione.

4. Quanto acido nucleico è previsto?

Il DNA genomico ad alta abbondanza richiede una capacità legante sufficiente.

L’RNA virale e il cfDNA a basso numero di copie richiedono:

• Bassa perdita non specifica;

• Cinetica di cattura efficiente;

• Eluizione di piccolo volume;

• Rimozione di forti inibitori;

• Perdita di trasferimento minima.

5. Quali dimensioni dei frammenti devono essere recuperati?

Il flusso di lavoro potrebbe richiedere:

• DNA genomico ad alto peso molecolare;

• DNA genomico standard;

• RNA virale corto;

• Approssimativamente cfDNA nucleosomiale;

• Piccolo RNA;

• Un’ampia gamma di acidi nucleici totali.

Le condizioni della microsfera e del tampone insieme determinano quali dimensioni dei frammenti vengono recuperate.

6. Il processo è manuale o automatizzato?

I flussi di lavoro manuali possono tollerare un maggiore intervento dell'operatore.

I flussi di lavoro automatizzati richiedono:

• Erogazione uniforme delle microsfere;

• Sedimentazione controllata;

• Raccolta magnetica ripetibile;

• Miscelazione affidabile;

• Bassa perdita di aspirazione;

• Rilascio prevedibile dalle aste magnetiche.

7. Quale metodo a valle verrà utilizzato?

Le possibili applicazioni a valle includono:

• PCR;

• RT-PCR;

• qPCR;

• PCR digitale;

• Sequenziamento a lettura breve;

• Sequenziamento a lettura lunga;

• Digestione restrittiva;

• Clonazione;

• Genotipizzazione;

• Ibridazione.

Ciascun metodo presenta requisiti diversi in termini di purezza, integrità, concentrazione e rimozione degli inibitori.

8. Quale volume commerciale è richiesto?

Un cliente ricercatore potrebbe aver bisogno solo di pochi millilitri.

Un produttore di kit di estrazione potrebbe richiedere:

• Lotti pilota;

• Produzione di più litri;

• Lotti riservati;

• Accordi di qualità;

• Notifica di modifica;

• Scorte commerciali di sicurezza;

• Confezione OEM.

Specifiche chiave della perla magnetica in silice

Dimensione delle particelle e distribuzione dimensionale

Il diametro delle particelle influenza:

• Superficie disponibile;

• Cinetica di legame;

• Raccolta magnetica;

• Sedimentazione;

• Erogazione;

• Ridisperdibilità;

• Riporto di perline.

Le particelle più piccole generalmente forniscono una maggiore area superficiale per unità di massa. Ciò può essere utile per campioni a bassa concentrazione, ma le sfere più piccole possono anche:

• Richiede più tempo per la raccolta;

• Rimangono sospesi dopo la separazione magnetica;

• Essere più facilmente aspirabile;

• Richiede un magnete più forte;

• Aumenta il carryover delle perline.

Le perle più grandi possono fornire:

• Raccolta magnetica più veloce;

• Ispezione visiva più semplice;

• Minore rischio di aspirazione.

Tuttavia, possono anche:

• Sistemarsi più rapidamente;

• Fornire meno superficie per unità di massa;

• Erogare in modo meno coerente;

• Richiede una miscelazione più attiva.

Chiedere al fornitore una dimensione superiore a quella nominale.

Le specifiche utili includono:

• Diametro medio delle particelle;

• D10;

• D50;

• D90;

• Coefficiente di variazione;

• Indice di polidispersità;

• Metodo di misurazione.

Una distribuzione ristretta delle dimensioni delle particelle può migliorare l'erogazione, la risposta magnetica e la riproducibilità da un'analisi all'altra.

Chimica della superficie della silice e area superficiale

La superficie della silice fornisce l'interfaccia legante l'acido nucleico.

Le domande importanti includono:

• Il rivestimento di silice è continuo?

• La superficie è porosa o non porosa?

• Qual è la superficie utilizzabile?

• Quanto è stabile lo strato di silice?

• I gruppi silanolici sono accessibili?

• La superficie rilascia silice o ferro?

• Il rivestimento è uniforme tra i lotti?

Una superficie teorica elevata non è automaticamente vantaggiosa.

Le superfici molto porose o molto strutturate possono:

• Aumentare il legame;

• Intrappola le impurità;

• Rendere il lavaggio più difficile;

• Ridurre l'efficienza di eluizione.

La superficie utilizzabile dovrebbe essere valutata attraverso prove di estrazione effettive piuttosto che desunta solo dalla caratterizzazione fisica.

Contenuto magnetico e velocità di raccolta

Il nucleo magnetico consente una rapida separazione solido-liquido.

Importanti misurazioni delle prestazioni includono:

• Tempo necessario al movimento iniziale del cordone;

• È ora di completare la raccolta magnetica;

• Torbidità residua dopo la raccolta;

• Percentuale di sfere perse nel surnatante;

• Risposta magnetica nel volume effettivo del campione;

• Risposta con il magnete previsto.

Una risposta magnetica più forte può ridurre i tempi di elaborazione.

Tuttavia, il contenuto magnetico deve essere bilanciato con:

• Area superficiale della silice;

• Densità delle particelle;

• Ridisperdibilità;

• Stabilità delle sospensioni;

• Capacità degli acidi nucleici.

Le sfere molto dense possono depositarsi rapidamente durante il riempimento dei reagenti o il trattamento delle piastre.

Promega osserva che l'immobilizzazione magnetica incompleta può portare alla perdita di sferette e alla ridotta resa di acido nucleico. Il tempo di raccolta magnetica richiesto dipende dalle sfere, dalla configurazione del magnete e dal sistema di gestione dei liquidi.

Capacità di legare gli acidi nucleici

La capacità di legame viene spesso riportata come quantità di DNA per milligrammo o millilitro di sfere.

Tuttavia, il valore riportato è significativo solo quando le condizioni del test sono note.

Chiedere al fornitore di specificare:

• tipo di DNA o RNA;

• Lunghezza del frammento;

• Composizione del tampone;

• pH;

• Concentrazione di sale;

• Concentrazione di alcol;

• Tempo di incubazione;

• Concentrazione delle perle;

• Metodo di misurazione.

La capacità misurata utilizzando il DNA genomico purificato può sovrastimare le prestazioni in un lisato biologico complesso.

La capacità pratica può essere inferiore perché:

• Le proteine ​​competono per la superficie;

• Gli inibitori rimangono nel lisato;

• La viscosità del campione riduce la miscelazione;

• Le particelle si aggregano;

• L'acido nucleico è intrappolato nei detriti;

• Il tempo di rilegatura è limitato.

Selezionare la microsfera in base al recupero utilizzabile nel flusso di lavoro target, non alla capacità teorica più alta.

Ridisperdibilità

La ridisperdibilità descrive la facilità con cui il pellet di sfere ritorna in una sospensione uniforme dopo la raccolta magnetica.

Colpisce direttamente:

• Lavaggio;

• Rimozione dei contaminanti;

• Eluizione;

• Disponibilità della superficie vincolante;

• Consistenza automatizzata.

Una scarsa ridisperdibilità può causare:

• Lavaggio incompleto;

• Sali intrappolati;

• Resa ridotta;

• Valori Ct variabili;

• Eluizione incompleta;

• Carryover degli inibitori.

Valutare la ridisperdibilità dopo:

• Stoccaggio iniziale;

• Legame;

• Ogni lavaggio;

• Essiccazione controllata;

• Eluizione.

Una perla che si disperde bene in acqua può comportarsi diversamente in un lisato viscoso o in un tampone di lavaggio ricco di alcol.

Stabilità in sospensione e sedimentazione

Le perle magnetiche sono più dense dell'acqua e col tempo si depositano.

La questione chiave è se rimangono sufficientemente uniformi durante:

• Pipettaggio manuale;

• Erogazione automatizzata;

• Riempimento kit;

• Configurazione della piastra;

• Operazioni di erogazione multipla.

La sedimentazione rapida può causare differenze di concentrazione tra:

• Il primo e l'ultimo pozzetto;

• Bottiglie diverse;

• Momenti diversi durante un ciclo di produzione.

Valutare:

• Tempo di assestamento;

• Facilità di risospensione del flacone;

• Frequenza di miscelazione necessaria durante l'erogazione;

• Uniformità di concentrazione su una piastra;

• Prestazioni dopo lo stoccaggio.

La stabilità e la ridisperdibilità delle sospensioni sono correlate ma non identiche.

Una perla può depositarsi rapidamente ma ridisperdersi facilmente, oppure rimanere sospesa più a lungo ma formare una pallina compatta e difficile dopo la raccolta magnetica.

Concentrazione di solidi

La concentrazione delle sfere fornite influisce su:

• Precisione del dosaggio;

• Volume di spedizione;

• Miscelazione;

• Viscosità;

• Formulazione del kit;

• Efficienza produttiva.

Confermare se la concentrazione è riportata come:

• Peso per volume;

• Peso per peso;

• Solidi secchi;

• Conteggio delle particelle per millilitro.

Uno stock altamente concentrato può ridurre il volume di spedizione e di stoccaggio, ma potrebbe essere più difficile ridisperderlo o distribuirlo in modo accurato.

Il cliente deve verificare la concentrazione utilizzando un metodo analitico concordato.

Compatibilità tampone e additiva

Le perle commerciali possono essere fornite in acqua o in una formulazione di conservazione contenente:

• Respingente;

• Tensioattivo;

• Stabilizzatore;

• Conservante;

• Sali.

Questi materiali possono influenzare:

• Chimica legante;

• Lisi;

• Proteinasi K;

• RT-PCR;

• Attività enzimatica;

• Stabilità colloidale.

Chiedere al fornitore di rivelare:

• Identità del buffer;

• pH;

• Tipo di tensioattivo;

• Conservante;

• Forza ionica;

• temperatura di conservazione.

Una perla grezza destinata alla produzione di IVD deve essere valutata per la compatibilità con la chimica di estrazione completa.

Come scegliere le perline per l'estrazione del DNA o dell'RNA

Le sfere magnetiche di silice possono legare sia il DNA che l'RNA in adeguate condizioni ad alto contenuto di sale. QIAGEN descrive la purificazione delle particelle magnetiche come un legame caotropico assistito da sale seguito da lavaggio ed eluizione con poco o nessun sale.

Tuttavia, i flussi di lavoro DNA e RNA hanno requisiti operativi diversi.

Scelta delle perline per il DNA genomico

Dai priorità:

• Capacità legante adeguata;

• Rimozione efficiente delle proteine;

• Buona eluizione;

• Riporto limitato delle perline;

• Compatibilità con la lunghezza del DNA desiderata.

Per il sequenziamento a lettura lunga, valutare se la miscelazione e la manipolazione delle sfere tagliano il DNA.

Scelta delle perline per l'RNA totale

Dai priorità:

• Elaborazione rapida;

• Produzione e manipolazione senza RNasi;

• Recupero dell'intervallo di dimensioni dell'RNA richiesto;

• Rimozione del DNA genomico;

• Compatibilità con reagenti riducenti e caotropici.

Scelta delle perle per l'RNA virale

Dai priorità:

• Recupero a basso input;

• Elevata efficienza di cattura;

• Rimozione degli inibitori;

• Eluizione di piccolo volume;

• compatibilità con RT-qPCR.

Scelta delle perline per l'acido nucleico totale

Un metodo per l'acido nucleico totale dovrebbe recuperare sia il DNA che l'RNA in modo coerente.

Non dare per scontato che una microsfera validata per il DNA genomico recupererà automaticamente il piccolo RNA, l’RNA virale frammentato e il DNA genomico con la stessa efficienza.

Come scegliere le perline in base al tipo di campione

Sangue intero

Il sangue intero contiene:

• cellule;

• Proteine ​​plasmatiche;

• eme;

• Lipidi;

• Anticoagulanti.

Scegli perle che forniscono:

• Forte risposta magnetica nel lisato viscoso;

• Ridispersione efficiente;

• Adeguata capacità del DNA genomico;

• Basso carryover proteico;

• Compatibilità con Proteinasi K e sali caotropici.

Testare diversi volumi di sangue immesso e livelli di ematocrito.

Plasma e siero

Plasma e siero generalmente contengono basse concentrazioni di acidi nucleici liberi e alte concentrazioni di proteine.

Dai priorità:

• Elevato recupero con un basso numero di copie;

• Cattura efficiente di frammenti brevi;

• Bassa perdita non specifica;

• Piccolo volume di eluizione;

• Trascinamento minimo delle perline.

Thermo Fisher descrive i suoi flussi di lavoro cfDNA utilizzando una chimica ottimizzata di sfere simili alla silice ed eluizione a basso volume per recuperare acidi nucleici circolanti a bassa concentrazione da campioni privi di cellule.

Tamponi virali e mezzi di trasporto

I tamponi e i terreni di trasporto virale possono contenere:

• Muco;

• proteine;

• Sali;

• Antibiotici;

• Prodotti chimici inattivanti;

• Acidi nucleici virali a bassa copia.

Dai priorità:

• Recupero di RNA e DNA virale;

• Compatibilità con i mezzi di trasporto;

• Rimozione degli inibitori della RT-PCR;

• Estrazione veloce;

• Compatibilità con l'automazione.

Nella convalida dovrebbero essere incluse diverse marche di mezzi di trasporto.

Cellule e tessuti animali

Cellule e tessuti richiedono una sufficiente lisi e digestione delle proteine.

La selezione delle perle dovrebbe considerare:

• Massa in ingresso tissutale;

• Bersaglio di DNA o RNA;

• Viscosità del campione;

• Digestione della proteinasi K;

• metodo di omogeneizzazione;

• Requisiti di DNA ad alto peso molecolare.

La lisi incompleta dei tessuti non può essere corretta aumentando solo la quantità di sfere.

Tessuto vegetale

I campioni di piante possono contenere:

• Polisaccaridi;

• Polifenoli;

• Pigmenti;

• Cellulosa;

• Metaboliti secondari.

Scegli una combinazione di perline e tampone che:

• Tollera una forte chimica della lisi vegetale;

• Rimuove polifenoli e polisaccaridi;

• Mantiene la raccolta magnetica nel materiale viscoso;

• Produce acidi nucleici compatibili con la PCR.

La selezione delle sfere deve essere eseguita insieme alla chimica di rimozione degli inibitori.

Batteri e funghi

I campioni microbici possono richiedere:

• Digestione enzimatica della parete cellulare;

• Interruzione meccanica;

• Trattamento termico;

• Battitura delle perline.

Per il DNA genomico batterico, valutare se il flusso di lavoro debba preservare il DNA ad alto peso molecolare.

Per i campioni fungini, testare la rimozione di polisaccaridi e pigmenti.

Campioni di feci, terreno e alimenti

Queste matrici possono contenere alti livelli di inibitori della PCR.

Gli esempi includono:

• Sali biliari;

• Acidi umici;

• Polisaccaridi;

• Grassi;

• Proteine ​​complesse;

• Additivi di lavorazione.

Dai priorità alle prestazioni di purificazione piuttosto che alla massima resa grezza.

Una resa leggermente inferiore con migliore amplificabilità può essere preferibile a una resa maggiore contenente inibitori.

Campioni FFPE

Il materiale fissato in formalina e incluso in paraffina presenta sfide tra cui:

• Proteine ​​reticolate;

• Acidi nucleici frammentati;

• Modifiche chimiche;

• Bassa quantità recuperabile;

• Contaminazione da paraffina.

Dai priorità:

• Recupero di frammenti brevi;

• Forte rimozione delle impurità;

• Eluizione a basso volume;

• Riproducibilità a basso input.

La perla deve essere convalidata insieme alle fasi di deparaffinazione, dereticolazione e digestione.

DNA libero da cellule

Il cfDNA è tipicamente presente a bassa concentrazione ed è costituito in gran parte da brevi frammenti.

Dai priorità:

• Ampia superficie effettiva;

• Cattura efficiente di frammenti brevi;

• Movimentazione di liquidi a basse perdite;

• Eluizione di piccolo volume;

• Alta riproducibilità;

• Compatibilità con input di plasma di grandi dimensioni.

Non selezionare le sfere di cfDNA solo in base alla loro dimensione fisica. La chimica del tampone e l’architettura di estrazione sono ugualmente importanti.

In che modo la dimensione dei frammenti di acido nucleico influisce sulla selezione delle microsfere

La dimensione dei frammenti influenza la cinetica di adsorbimento, il recupero e l'eluizione.

DNA ad alto peso molecolare

Per il DNA lungo, valutare:

• Lisi delicata;

• Miscelazione delicata;

• Trasferimento a basso taglio;

• Eluizione completa;

• Puntali per pipette a diametro largo;

• Vortex minimo.

Una sfera altamente efficiente può comunque produrre DNA frammentato se il flusso di lavoro è meccanicamente aggressivo.

DNA genomico standard

I flussi di lavoro di routine della PCR e della genotipizzazione solitamente danno priorità a:

• Prodotto;

• Purezza;

• Coerenza;

• rimozione degli inibitori.

Brevi frammenti di DNA

I frammenti corti possono andare persi se le condizioni di legame non sono sufficientemente forti o se la combinazione di sfere e tampone favorisce un DNA più lungo.

RNA piccolo e RNA frammentato

Il recupero di piccoli RNA deve essere verificato utilizzando le distribuzioni effettive dei frammenti.

Una richiesta di RNA totale non garantisce necessariamente un recupero efficiente del microRNA.

cfDNA

L'estrazione del cfDNA richiede un recupero efficiente di frammenti corti e poco abbondanti da volumi di campione relativamente grandi.

I sistemi di estrazione specifici del campione possono utilizzare superfici ottimizzate simili alla silice ed eluizione di piccoli volumi per concentrare questi target.

Come scegliere le perle per l'estrazione manuale

Per l'estrazione manuale, dare priorità a:

• Facile ispezione visiva;

• Raccolta affidabile su un rack magnetico standard;

• Buona maneggevolezza della pipetta;

• Basso trascinamento del tallone;

• Ridispersione facile del pellet;

• Tolleranza a piccole variazioni temporali.

Valutare il flusso di lavoro con diversi operatori.

I test manuali dovrebbero determinare:

• Tempo vincolante;

• Metodo di miscelazione;

• Tempo di raccolta magnetica;

• Cicli di lavaggio;

• tempo di asciugatura;

• Tempo e temperatura di eluizione.

Un metodo manuale efficace è utile come flusso di lavoro di riferimento prima dell'automazione.

Come scegliere le perline per l'estrazione automatizzata

L'estrazione automatizzata impone requisiti aggiuntivi.

Le perle devono supportare:

• Erogazione automatizzata coerente;

• Immobilizzazione magnetica rapida;

• Risospensione prevedibile;

• Decantazione limitata;

• Cicli di lavaggio ripetuti;

• Basso carryover tra pozzi;

• Prestazioni stabili su una piastra completa.

Promega identifica la miscelazione come una delle fonti più comuni di problemi di estrazione automatizzata. La viscosità della soluzione, la miscibilità del liquido, la dimensione e la densità delle sfere influenzano tutti l'efficienza della miscelazione automatizzata.

Valutare l'erogazione automatizzata

Testare la concentrazione delle sferette in:

• Il primo bene;

• I pozzi medi;

• Il pozzo finale;

• Piatti diversi;

• Punti diversi durante il ciclo di dispensazione.

Valutare la raccolta magnetica

Misura:

• Orario di ritiro;

• Perle residue nel surnatante;

• Perdita del tallone;

• Autorizzazione all'aspirazione;

• Riporto nell'eluato.

Valutare la miscelazione

Controllare se lo strumento risospende completamente le sfere durante:

• Legame;

• Lavaggio;

• Eluizione.

Sistemi a barra magnetica e postazioni di lavoro per la gestione dei liquidi

Sistemi a barra magnetica

Un'asta magnetica o un motore per particelle trasferisce le microsfere tra i pozzetti dei reagenti.

Dai priorità:

• Forte raccolta magnetica;

• Rilascio affidabile dal copriasta;

• Buona ridispersione delle perle;

• Resistenza ai trasferimenti ripetuti;

• Bassa ritenzione del tallone residuo.

Postazioni di lavoro per la gestione dei liquidi

Le perle rimangono nel recipiente mentre i liquidi vengono aggiunti e rimossi.

Dai priorità:

• Raccolta rapida tramite parete laterale o anello magnetico;

• Bassa perdita di aspirazione;

• Sospensione stabile durante l'erogazione;

• Compatibilità con la miscelazione con pipette;

• Basso riporto del tallone.

La geometria del magnete influisce sulla posizione del pellet di sfere e sul volume che può essere aspirato in sicurezza. Promega osserva che i magneti ad anello e a palo creano diversi modelli di raccolta delle perline e possono richiedere diverse strategie di eluizione o aspirazione.

Come abbinare le perline ai tamponi di rilegatura e di lavaggio

Le sfere di silice non devono mai essere valutate indipendentemente dal sistema tampone.

L'estrazione a base di silice utilizza generalmente condizioni ioniche controllate: gli acidi nucleici si legano in condizioni ad alto contenuto di sale o caotropiche e vengono rilasciati in condizioni di basso contenuto di sale.

Associazione delle variabili del buffer

I parametri importanti includono:

• Tipo di sale caotropico;

• Concentrazione di sale;

• pH;

• Concentrazione di alcol;

• Detergente;

• Rapporto campione-tampone;

• Tempo vincolante.

Variabili del buffer di lavaggio

I tamponi di lavaggio dovrebbero rimuovere:

• Proteina;

• Detergente;

• Sali caotropici;

• Inibitori del campione;

• lipidi;

• pigmenti.

Devono inoltre mantenere il legame dell'acido nucleico durante il lavaggio.

Variabili di eluizione

L'eluizione dipende da:

• Forza ionica tampone;

• pH;

• Volume;

• Temperatura;

• Incubazione;

• Miscelazione.

Un recente studio sull'estrazione delle sferette di silice ha rilevato che il pH legante, il movimento delle sferette, la durata del legame, il pH di eluizione, la temperatura e il tempo di eluizione sono tutti fattori che influenzano la resa finale dell'acido nucleico.

Cambiare il fornitore delle perle può quindi richiedere la riottimizzazione di:

• Volume del buffer di legame;

• Quantità di perline;

• Tempo magnetico;

• Cicli di lavaggio;

• Essiccazione;

• Eluizione.

Perle magnetiche di silice vs Perle magnetiche carbossiliche

Le sfere magnetiche di silice e carbossile vengono utilizzate in diversi tipi di flussi di lavoro relativi agli acidi nucleici.

Questa divisione non è assoluta perché le formulazioni commerciali variano.

Tuttavia, le particelle magnetiche rivestite di silice sono comunemente utilizzate per estrarre gli acidi nucleici da campioni biologici complessi, mentre le perle carbossilate di tipo SPRI sono ampiamente utilizzate per la pulizia PCR e la purificazione delle librerie NGS.

Non sostituire una superficie con un'altra senza riottimizzare l'intero sistema tampone.

Come valutare le perline candidate

Un programma di screening utile dovrebbe includere, ove possibile, almeno tre sfere candidate.

Fase 1: valutazione fisica

Misura:

• Dimensione delle particelle;

• Distribuzione dimensionale;

• Concentrazione di solidi;

• Tempo di raccolta magnetica;

• Sedimentazione;

• Ridisperdibilità;

• Perle residue dopo la separazione.

Fase 2: valutazione vincolante

Utilizzare DNA o RNA purificati per confrontare:

• Capacità vincolante;

• Velocità di rilegatura;

• Recupero;

• Efficienza di eluizione;

• Recupero delle dimensioni di un frammento.

Fase 3: valutazione della matrice

Testare il tipo di campione effettivo.

Confrontare:

• Prodotto;

• Purezza;

• amplificabilità;

• rimozione degli inibitori;

• precisione.

Fase 4: valutazione dell'automazione

Valutare:

• Consistenza dell'erogazione;

• Uniformità della piastra;

• Raccolta magnetica;

• Miscelazione;

• riporto di perline;

• contaminazione incrociata.

Fase 5: valutazione della stabilità

Test:

• Archiviazione in tempo reale;

• Archiviazione accelerata;

• congelare l'esposizione ove pertinente;

• simulazione dei trasporti;

• stabilità a bottiglia aperta;

• miscelazione ripetuta.

Test prestazionali consigliati

Nessuna singola misurazione dovrebbe essere utilizzata da sola.

Ad esempio, l’assorbanza UV può sovrastimare la concentrazione dell’acido nucleico quando sali residui o altri composti assorbono la luce. La qPCR funzionale o le prestazioni di sequenziamento forniscono prove più dirette della qualità di estrazione utilizzabile.

Errori comuni di selezione

Scegliendo solo in base al diametro delle particelle

Due perle con la stessa dimensione nominale possono differire in:

• Contenuto magnetico;

• Rivestimento in silice;

• superficie;

• distribuzione dimensionale;

• stabilità della sospensione;

• prestazione vincolante.

Scegliere la capacità legante più alta

Una capacità molto elevata potrebbe non essere necessaria e potrebbe non migliorare il recupero da campioni a basso input.

Ignorando la compatibilità del separatore magnetico

Una perla che funziona bene su un magnete potrebbe raccogliersi lentamente o in modo non uniforme su un altro.

Ignorando la sedimentazione

Le sfere a sedimentazione rapida possono creare notevoli variazioni di concentrazione durante l'erogazione automatizzata.

Testare solo il DNA purificato

Le prestazioni con l'acido nucleico purificato non prevedono la rimozione delle impurità dai campioni di sangue, feci, piante o FFPE.

Valutazione della resa senza amplificabilità

Un eluato ad alta resa può contenere inibitori della PCR.

Supponendo che le prestazioni del DNA e dell'RNA siano identiche

Diversi tipi di acidi nucleici e dimensioni dei frammenti richiedono una convalida separata.

Cambiare le sfere senza riottimizzare i buffer

Perle e tamponi formano un sistema integrato. Una sostituzione diretta può alterare il legame, il lavaggio e l'eluizione.

Ignorando le specifiche commerciali

Un campione di ricerca di successo non è sufficiente per la produzione commerciale senza:

• Specifiche del lotto;

• Dati ingranditi;

• cambiare controllo;

• continuità della fornitura.

Risoluzione dei problemi dopo la sostituzione delle perline magnetiche

Modificare una variabile alla volta durante la risoluzione dei problemi.

Come confrontare produttori e fornitori

Valutare il fornitore in quattro aree.

Capacità del prodotto

Confermare:

• Granulometrie disponibili;

• Capacità di dimensioni personalizzate;

• Concentrazione di solidi;

• Chimica delle superfici;

• Risposta magnetica;

• Dati dell'applicazione.

Capacità di qualità

Richiesta:

• Certificato di analisi;

• Scheda dati di sicurezza;

• Rapporto sulla dimensione delle particelle;

• Dati sulle prestazioni magnetiche;

• Tracciabilità dei lotti;

• Informazioni sulla stabilità;

• Documentazione del sistema qualità.

Capacità commerciale

Confermare:

• Disponibilità del campione;

• Quantità dell'ordine pilota;

• Capacità commerciale;

• Tempi di consegna;

• Scorta di sicurezza;

• lotti riservati;

• opzioni di imballaggio.

Capacità tecnica

Chiedi se il fornitore può supportare:

• Screening delle perle;

• Compatibilità buffer;

• Trasferimento dell'automazione;

• Risoluzione dei problemi;

• sviluppo personalizzato;

• indagine su larga scala.

Un distributore può essere adatto per gli ordini di ricerca. Un produttore diretto è generalmente preferibile per lo sviluppo OEM, particelle personalizzate, accordi di qualità e fornitura commerciale.

Perline magnetiche in silice standard o personalizzate

I prodotti standard rappresentano solitamente il miglior punto di partenza perché forniscono:

• Campionamento più veloce;

• Specifiche esistenti;

• Costi di sviluppo inferiori;

• Tempi di consegna più brevi;

• Confronto più semplice.

Le perline magnetiche personalizzate possono essere appropriate quando il progetto richiede:

• Una dimensione delle particelle non standard;

• Risposta magnetica più rapida;

• Decantazione ridotta;

• Spessore diverso della silice;

• Concentrazione di solidi maggiore o minore;

• Un buffer di archiviazione personalizzato;

• Imballaggio specifico;

• Compatibilità con un estrattore proprietario.

Prima di iniziare un progetto personalizzato, definire criteri di accettazione misurabili.

Gli esempi includono:

• Ritiro entro un tempo determinato;

• Recupero minimo del DNA;

• Massimo trascinamento del cordone;

• Massima variazione Ct;

• Intervallo di dimensioni delle particelle definito;

• Periodo di validità richiesto.

Informazioni da includere in una richiesta di offerta

Una richiesta di offerta completa di perline magnetiche in silice dovrebbe includere:

1. Acido nucleico bersaglio;

2. Tipo di campione;

3. Volume di ingresso del campione;

4. Concentrazione prevista di acido nucleico;

5. Intervallo di dimensioni dei frammenti richiesto;

6. Estrazione manuale o automatizzata;

7. Strumento di estrazione;

8. Formato con asta magnetica o con dispositivo di gestione dei liquidi;

9. Tipo a tubo o piastra;

10. throughput richiesto;

11. Dimensione delle particelle target, se nota;

12. Tempo di raccolta magnetico richiesto;

13. Capacità vincolante richiesta;

14. Concentrazione delle perle;

15. Chimica del tampone di legame;

16. Chimica dei tamponi di lavaggio;

17. Volume di eluizione;

18. Analisi a valle;

19. Recupero richiesto;

20. Purezza richiesta;

21. Massimo trascinamento del cordone;

22. Quantità di campione;

23. Quantità dell'ordine pilota;

24. Volume annuo stimato;

25. Requisiti di imballaggio;

26. Documenti di qualità richiesti;

27. Obiettivo di durata di conservazione;

28. Requisiti di prenotazione del lotto;

29. Requisiti di notifica delle modifiche;

30. Requisiti OEM o di marchio privato.

Fornire queste informazioni permette al produttore di consigliare una particella più adeguata rispetto ad una richiesta basata solo sul diametro.

Domande frequenti

Qual è la dimensione migliore della perla magnetica di silice?

Non esiste una dimensione migliore universale. Le particelle più piccole possono fornire una superficie maggiore, mentre le particelle più grandi possono raccogliersi più velocemente ed essere più facili da maneggiare. La dimensione corretta dipende dal campione, dal buffer, dal magnete e dalla piattaforma di automazione.

Le sfere magnetiche più piccole sono migliori per l’estrazione del DNA?

Non sempre. Le sfere più piccole possono offrire un'area superficiale elevata ma possono separarsi più lentamente e aumentare il carryover.

Come scelgo le sfere per l'estrazione dell'RNA?

Dai priorità al recupero efficiente a basso input, alla manipolazione priva di RNasi, al recupero di dimensioni dell'RNA adeguate e alla compatibilità con reagenti caotropici e riducenti.

Le stesse perle possono estrarre DNA e RNA?

Sì, le perle di silice possono legare sia il DNA che l'RNA. La selettività dipende dal sistema tampone, dalla preparazione del campione e dai trattamenti enzimatici.

Quali sfere sono le migliori per l'RNA virale?

Scegli sfere che garantiscono un elevato recupero con un basso numero di copie, rimozione degli inibitori, automazione rapida ed eluizione in piccoli volumi.

Quali sfere sono le migliori per il DNA genomico?

Scegliere sfere con capacità sufficiente, rimozione efficiente delle proteine, buona eluizione e condizioni di manipolazione adeguate alla lunghezza del DNA desiderata.

Quali sfere sono le migliori per il cfDNA?

Dare priorità al recupero di frammenti corti e poco abbondanti, alla compatibilità con grandi volumi di plasma e all'eluizione di piccoli volumi.

Cos’è la capacità vincolante?

La capacità di legame è la quantità di acido nucleico che può essere catturato in condizioni specificate. Dovrebbe essere sempre riportato insieme al tampone, al tipo di acido nucleico e al metodo di misurazione.

La capacità di rilegatura più alta è sempre la migliore?

No. Il recupero pratico, la rimozione delle impurità e l'efficienza di eluizione sono più importanti della capacità teorica massima.

Quanto velocemente dovrebbero raccogliersi le perline su un magnete?

Il tempo accettabile dipende dal flusso di lavoro e dal magnete. Dovrebbe essere misurato nella provetta, nella piastra, nel volume e nel tampone previsti.

Perché le perle magnetiche si depositano?

Contengono materiale magnetico denso. La dimensione delle particelle, la densità, la concentrazione e la formulazione della sospensione influenzano la sedimentazione.

Perché è importante la ridisperdibilità?

Il legame, il lavaggio e l'eluizione richiedono che le sfere entrino in contatto con il liquido in modo efficiente. Una scarsa ridispersione riduce la resa e la purezza.

Le sfere possono essere utilizzate su qualsiasi strumento di estrazione?

Non automaticamente. La geometria del magnete, la miscelazione, il formato del recipiente e la gestione dei liquidi differiscono a seconda degli strumenti.

Devo cambiare il tampone quando cambio fornitore di perline?

Forse. Differenti superfici di silice e design delle particelle possono modificare il comportamento di legame, lavaggio ed eluizione.

Quante perle candidate dovrebbero essere valutate?

Testare almeno tre candidati idonei fornisce un confronto migliore rispetto alla valutazione di un solo prodotto.

È possibile utilizzare le sfere magnetiche di silice per la purificazione della PCR?

Possono essere adattati ad alcuni flussi di lavoro di pulizia, sebbene le sfere di tipo SPRI carbossilate siano più comunemente utilizzate per la pulizia delle librerie PCR e NGS.

Quali documenti di qualità dovrebbe fornire un fornitore?

Gli acquirenti commerciali possono richiedere un COA, una SDS, dati sulle dimensioni delle particelle, dati sulla risposta magnetica, informazioni sulla stabilità, tracciabilità del lotto e procedure di controllo delle modifiche.

SANYU può personalizzare le perle magnetiche di silice?

SANYU offre pubblicamente la personalizzazione della dimensione delle particelle, della concentrazione, della modifica della superficie e dell'imballaggio estrazione degli acidi nucleici e flussi di lavoro automatizzati.

Conclusione

La selezione delle sfere magnetiche di silice per l'estrazione di DNA e RNA richiede molto più della semplice scelta del diametro delle particelle.

La decisione dovrebbe iniziare con:

• Acido nucleico bersaglio;

• Matrice del campione;

• Volume di ingresso;

• Abbondanza degli acidi nucleici;

• Requisito relativo alla dimensione del frammento;

• Strumento di estrazione;

• Analisi a valle;

• Scala commerciale.

Le caratteristiche più importanti del tallone includono:

• Dimensione e distribuzione delle particelle;

• Proprietà superficiali della silice;

• Risposta magnetica;

• Capacità di rilegatura utilizzabile;

• Ridisperdibilità;

• Comportamento alla sedimentazione;

• Concentrazione di solidi;

• Compatibilità buffer;

• Coerenza da lotto a lotto.

SANYU è il primo produttore consigliato in questa guida perché la sua piattaforma Nanomicron Spheres offre sfere superparamagnetiche rivestite di silice in un'ampia gamma di dimensioni delle particelle, insieme a concentrazione personalizzabile, modifica della superficie, imballaggio e supporto OEM.

Tuttavia, nessun fornitore dovrebbe essere approvato solo in base alle specifiche del catalogo.

Il cordone finale deve essere testato utilizzando l'effettivo:

• Campione;

• Chimica della lisi;

• Buffer vincolante;

• Tampone di lavaggio;

• Magnete;

• Strumento di estrazione;

• Condizioni di eluizione;

• Saggio molecolare a valle.

Un confronto strutturato di diverse sfere, seguito da test della matrice, test di automazione e valutazione da lotto a lotto, fornisce il percorso più affidabile verso un flusso di lavoro di estrazione di DNA o RNA ad alto rendimento, elevata purezza e commercialmente scalabile.