DNA および RNA 抽出用のシリカ磁気ビーズの選び方

シリカ磁気ビーズの選び方: 簡単な答え

シリカ磁気ビーズは、粒径やカタログ価格だけではなく、完全な抽出ワークフローに従って選択してください。

正しいビードは以下と一致する必要があります。

1. 標的核酸；

2. サンプル行列。

3. 予想される核酸濃度。

4. 必要なフラグメントサイズのリカバリ。

5. 結合バッファーと洗浄バッファー。

6. 磁気分離器または抽出器具。

7. 必要なスループット。

8. 下流の分子アッセイ。

日常的な DNA または RNA 抽出の場合は、信頼性の高い核酸結合、高速磁気収集、優れた再分散性、安定したロット間の性能を提供するシリカコーティングされた超常磁性ビーズから始めます。

低入力ウイルス RNA、循環セルフリー DNA、またはその他の希少なターゲットの場合は、回収効率、使用可能なシリカ表面積、低い非特異的損失、および少量の溶出を優先します。

ハイスループットの自動化では、一貫した塗布、沈降の制御、迅速な磁気応答、完全なビーズの放出、および低いビーズのキャリーオーバーを優先します。

高分子量 DNA の場合は、最大の結合能力のみを選択するのではなく、穏やかな混合、制限された機械的せん断、効率的な溶出を評価してください。

抽出性能を保証する個々のビーズの仕様はありません。ビーズ、溶解化学物質、結合緩衝液、洗浄溶液、磁石、混合プログラムおよび溶出条件は、1 つの統合された精製システムを形成します。

おすすめメーカー：1.SANYU

サンユー は機能性マイクロスフェアと磁性ビーズのメーカーです。 核酸抽出、分子診断、生物分離およびバイオテクノロジーの応用。

SANYU は Nanomicron Spheres プラットフォームを通じて、超常磁性 Fe₃O4 コアとシラノール基を含むシリカでコーティングされた表面からなるシリカ磁気ビーズを供給しています。この粒子は、適切な緩衝条件下で DNA と RNA が可逆的に結合するように設計されています。

SANYU シリカ磁性ビーズのポートフォリオ

公的にリストされている粒子サイズは次のとおりです。

• 100nm;

• 200nm;

• 800nm;

• 1μm;

• 2μm;

• 5μm;

• 10μm;

• 20μm;

• 30μm;

• 50μm;

• 100μm;

• 200μm。

SANYU は、粒径、濃度、表面改質、パッケージングを研究室、診断、自動抽出用途に合わせてカスタマイズできると述べています。

主な用途

SANYU シリカ磁気ビーズは次の点で評価できます。

• ゲノム DNA 抽出;

• トータル RNA 抽出。

• ウイルスの DNA および RNA の精製。

• プラスミド DNA の精製。

• 微生物の核酸抽出;

• 植物の DNA および RNA の抽出。

• 分子診断薬の開発。

• 手動磁気分離;

• 自動化された核酸抽出。

• 抽出キットのOEM製造。

サンユーが第一位に位置する理由

SANYU は以下の特徴を備えているため、このガイドで最初に推奨されるメーカーとして位置付けられています。

• 磁性ビーズの直接製造。

• 広い粒径範囲。

• シリカでコーティングされた超常磁性粒子。

• カスタム濃度とパッケージング。

• OEMおよびODMサービス;

• 手動および自動ワークフローの互換性。

• 実験室用サンプルと商用量の供給。

このランキングは監査済みの市場シェアランキングではなく、編集者による推奨です。

最終的なビーズは、お客様の実際のサンプルマトリックス、バッファー、抽出機器、および下流アッセイとの比較テスト後にのみ選択する必要があります。

ビーズのサイズではなく、抽出ワークフローから開始する

よくある購入の間違いは、次のようなリクエストから始めることです。

1 μm のシリカ磁気ビーズが必要です。

粒子径は重要ですが、1μmが適切かどうかはお客様にはまだ分からないかもしれません。

より良い出発点は次のとおりです。

RT-qPCR では、96 サンプルの磁気ロッド装置を使用して、200 μL の血漿からウイルス RNA を 50 μL 未満の溶出量で抽出する必要があります。

この声明はサプライヤーに以下に関する情報を提供します。

• 標的核酸;

• サンプルマトリックス;

• 入力ボリューム。

• 自動化プラットフォーム。

• スループット;

• 必要な溶出量;

• ダウンストリームアプリケーション。

磁気ビーズの選択は、1 つの普遍的な製品仕様ではなく、サンプルの投入量、核酸の存在量、およびフラグメントの特性に依存します。商用抽出サプライヤーの選択ガイドも同様に、ルーチンサンプル、低入力核酸、断片化 DNA、および大容量 cfDNA ワークフローに従ってビーズ システムを分類しています。

精製 DNA 標準に最適なビーズが、次の場合には最適なビーズではない可能性があります。

• 全血。

• FFPE組織。

• スツール;

• 植物溶解物。

• ウイルス輸送媒体。

• 無細胞血漿。

したがって、粒子の仕様をリクエストする前に、完全なワークフローを定義する必要があります。

磁気ビーズを選択する前に答えるべき 8 つの質問

1. どの核酸を回収する必要がありますか?

ターゲットが以下であるかどうかを指定します。

• ゲノム DNA;

• 総RNA;

• ウイルスDNA;

• ウイルスRNA;

• プラスミド DNA;

• 無細胞 DNA;

• 無細胞 RNA;

• 低分子RNA;

• 微生物の DNA;

• 総核酸。

全核酸抽出に適したビーズは、追加のバッファーまたは酵素ステップを使用しないと、選択的な DNA または RNA の精製を提供できない場合があります。

2. サンプル行列とは何ですか?

マトリックスは、溶解要件と主要な汚染物質を決定します。

例えば：

• 全血にはタンパク質、ヘム、細胞が含まれています。

• 血漿には低濃度の核酸と豊富なタンパク質が含まれています。

• 植物組織には多糖類とポリフェノールが含まれています。

• 便には複雑な PCR 阻害剤が含まれています。

• FFPE 組織には、架橋および断片化された核酸が含まれています。

3. サンプル投入量はどれくらいですか?

50 μL のサンプルと 10 mL の血漿サンプルでは、​​非常に異なるビーズ量、混合、容器形式、磁気分離条件が必要です。

大量のサンプルには以下が必要になる場合があります。

• より多くの結合面。

• 混合が長くなる。

• 濃縮ステップ。

• より強力な磁気収集。

• 大型の船舶。

• 異なる自動化アーキテクチャ。

4. どれくらいの核酸が期待されますか?

大量のゲノム DNA には十分な結合能力が必要です。

低コピーのウイルス RNA と cfDNA には以下が必要です。

• 非特異的損失が少ない。

• 効率的な捕獲動態。

• 少量の溶出。

• 強力な阻害剤除去。

• 転送ロスを最小限に抑えます。

5. どのようなフラグメント サイズを回復する必要がありますか?

ワークフローには次のものが必要になる場合があります。

• 高分子量ゲノム DNA;

• 標準ゲノム DNA;

• 短いウイルスRNA。

• ほぼヌクレオソームの cfDNA。

• 低分子RNA;

• 広い総核酸範囲。

ビーズとバッファーの条件を組み合わせると、どのフラグメント サイズが回収されるかが決まります。

6. プロセスは手動ですか、それとも自動ですか?

手動ワークフローでは、オペレータの介入をより多く許容できます。

自動化されたワークフローには次のものが必要です。

• 一貫したビーズの供給。

• 沈降を制御。

• 再現可能な磁気収集。

• 信頼性の高い混合。

• 吸引損失が少ない。

• 磁気ロッドからの予測可能なリリース。

7. 下流ではどのような方法が使用されますか?

考えられる下流アプリケーションには以下が含まれます。

• PCR;

• RT-PCR;

• qPCR;

• デジタル PCR;

• ショートリードシーケンス。

• ロングリードシーケンス。

• 制限消化;

• クローン作成;

• ジェノタイピング;

• ハイブリダイゼーション。

各方法には、純度、完全性、濃度、阻害剤の除去に関して異なる要件があります。

8. どのくらいの商用ボリュームが必要ですか?

研究顧客は数ミリリットルしか必要としないかもしれません。

抽出キットのメーカーは以下を必要とする場合があります。

• パイロットバッチ。

• 複数リットルの生産。

• 予約済みのロット。

• 質契約。

• 変更通知;

• 商業用安全在庫。

• OEMパッケージ。

シリカ磁気ビーズの主な仕様

粒子サイズとサイズ分布

粒子径は以下に影響します。

• 利用可能な表面積;

• 結合動態;

• 磁気収集;

• 沈降;

• 調剤;

• 再分散性。

• ビーズキャリーオーバー。

一般に粒子が小さいほど、単位質量あたりの表面積が大きくなります。これは、低濃度のサンプルには役立ちますが、小さなビーズでは次のような場合もあります。

• 収集には時間がかかります。

• 磁気分離後も浮遊状態を維持します。

• より容易に吸引できるようになります。

• より強力な磁石が必要です。

• ビードキャリーオーバーを増加させます。

ビーズが大きいと、次のような効果が得られます。

• より高速な磁気収集。

• 目視検査が容易になります。

• 誤嚥のリスクが低くなります。

ただし、次のことも行う場合があります。

• より迅速に落ち着きます。

• 単位質量あたりの表面積が小さくなります。

• 分配の一貫性が低下します。

• より積極的な混合が必要です。

呼び寸法以上の場合は販売店にご相談ください。

有用な仕様には次のようなものがあります。

• 平均粒径;

• D10;

• D50;

• D90;

• 変動係数;

• 多分散性指数。

• 測定方法。

粒度分布が狭いと、塗布、磁気応答、および実行ごとの再現性が向上します。

シリカの表面化学と表面積

シリカ表面は核酸結合界面を提供します。

重要な質問には次のようなものがあります。

• シリカコーティングは連続的ですか？

• 表面は多孔質ですか、それとも無孔ですか?

• 使用可能な表面積はどれくらいですか?

• シリカ層はどの程度安定していますか?

• シラノール基はアクセス可能ですか?

• 表面からシリカや鉄が放出されますか?

• コーティングはバッチ間で一貫していますか?

高い理論表面積は自動的に有益になるわけではありません。

非常に多孔質な表面や高度にテクスチャーのある表面では、次のような問題が発生する可能性があります。

• 結合力を高めます。

• 不純物をトラップします。

• 洗濯をより困難にします。

• 溶出効率が低下します。

使用可能な表面積は、物理的特性からのみ推測するのではなく、実際の抽出試験を通じて評価する必要があります。

磁気コンテンツと収集速度

磁性コアにより、迅速な固液分離が可能になります。

重要なパフォーマンス測定には次のものが含まれます。

• ビードが最初に移動するまでの時間。

• 磁気収集を完了する時間です。

• 収集後の残留濁度。

• 上清中に失われたビーズの割合。

• 実際のサンプル体積における磁気応答。

• 意図した磁石で応答します。

磁気応答が強力であれば、処理時間を短縮できます。

ただし、磁性成分は以下のバランスを取る必要があります。

• シリカの表面積。

• 粒子密度;

• 再分散性。

• サスペンションの安定性。

• 核酸容量。

非常に高密度のビーズは、試薬の充填またはプレートの処理中に急速に沈降する可能性があります。

プロメガは、磁気固定化が不完全だとビーズの損失や核酸収量の減少につながる可能性があると指摘しています。必要な磁気収集時間は、ビーズ、磁石の構成、および液体処理システムによって異なります。

核酸結合能

結合能力は、多くの場合、ビーズ 1 ミリグラムまたはミリリットルあたりの DNA の量として報告されます。

ただし、報告された値は、テスト条件がわかっている場合にのみ意味を持ちます。

サプライヤーに次のことを指定するように依頼してください。

• DNA または RNA のタイプ。

• フラグメントの長さ。

• バッファー組成。

• pH;

• 塩分濃度;

• アルコール濃度;

• インキュベーション時間。

• ビーズ濃度;

• 測定方法。

精製されたゲノム DNA を使用して測定された能力は、複雑な生物学的ライセートにおけるパフォーマンスを過大評価する可能性があります。

実際の容量は、次の理由により低くなる可能性があります。

• タンパク質は表面をめぐって競合します。

• 阻害剤はライセート中に残ります。

• サンプルの粘度により混合が減少します。

• 粒子は凝集します。

• 核酸は破片に捕捉されます。

• 拘束時間は限られています。

理論上の最大容量ではなく、ターゲット ワークフローで使用可能な回収量に応じてビーズを選択します。

再分散性

再分散性は、磁気収集後にビーズ ペレットが均一な懸濁液にどれだけ容易に戻るかを表します。

それは以下に直接影響します。

• 洗浄;

• 汚染物質の除去。

• 溶出;

• 結合面の利用可能性。

• 自動化された一貫性。

再分散性が低いと、次のような問題が発生する可能性があります。

• 洗浄が不完全。

• 閉じ込められた塩。

• 収量の減少。

• 可変 Ct 値。

• 不完全な溶出;

• 阻害剤のキャリーオーバー。

次の後に再分散性を評価します。

• 初期ストレージ。

• バインディング;

• 洗濯のたびに。

• 制御された乾燥;

• 溶出。

水によく分散するビーズは、粘稠なライセートまたはアルコールを多く含む洗浄緩衝液中では異なる挙動を示す可能性があります。

懸濁および沈降の安定性

磁気ビーズは水よりも密度が高く、最終的には沈降します。

重要な問題は、次の場合にそれらが十分に均一に保たれるかどうかです。

• 手動ピペッティング。

• 自動分配。

• キットの充填。

• プレートのセットアップ。

• 複数回のディスペンス操作。

急速な沈降により、以下の間で濃度差が生じる可能性があります。

• 最初と最後の井戸。

• さまざまなボトル。

• 実稼働中のさまざまな時間。

評価する：

• 整定時間。

• ボトルの再懸濁が容易。

• 分注中に必要な混合頻度。

• プレート全体の濃度均一性。

• 保管後のパフォーマンス。

懸濁液の安定性と再分散性は関連していますが、同一ではありません。

ビーズはすぐに沈降しますが、容易に再分散する場合があります。または、より長く懸濁したままですが、磁気収集後にコンパクトなペレットを形成するのが困難な場合があります。

固形分濃度

供給されたビーズ濃度は以下に影響します。

• 投与精度。

• 出荷量;

• 混合;

• 粘度;

• キットの配合;

• 生産効率。

濃度が次のように報告されているかどうかを確認します。

• 体積あたりの重量。

• 重量あたりの重量。

• 乾燥固体;

• ミリリットルあたりの粒子数。

高度に濃縮された在庫は輸送量と保管量を減らすことができますが、再分散または正確に分配することが困難になる可能性があります。

お客様は、合意された分析方法を使用して濃度を検証する必要があります。

緩衝液と添加剤の互換性

市販のビーズは、水または以下を含む保存製剤に入れて供給されます。

• バッファ;

• 界面活性剤;

• スタビライザー;

• 防腐剤;

• 塩。

これらの物質は以下に影響を与える可能性があります。

• 結合化学;

• 溶解;

• プロテイナーゼK;

• RT-PCR;

• 酵素活性;

• コロイドの安定性。

サプライヤーに以下の開示を求めます。

• バッファのアイデンティティ。

• pH;

• 界面活性剤の種類;

• 防腐剤;

• イオン強度;

• 保管温度。

IVD 製造を目的とした未処理ビーズは、完全な抽出化学物質との適合性を評価する必要があります。

DNA 抽出用と RNA 抽出用のビーズの選び方

シリカ磁気ビーズは、適切な高塩条件下で DNA と RNA の両方に結合できます。 QIAGEN は、磁性粒子の精製を、カオトロピック塩による結合とそれに続く洗浄および低塩または無塩溶出として説明しています。

ただし、DNA ワークフローと RNA ワークフローには異なる操作要件があります。

ゲノム DNA 用のビーズの選択

優先順位を付ける:

• 適切な結合能力。

• 効率的なタンパク質除去。

• 良好な溶出。

• ビーズキャリーオーバーは限られています。

• 目的の DNA 長との互換性。

ロングリードシーケンスの場合、混合とビーズの取り扱いによって DNA が切断されるかどうかを評価します。

total RNA 用のビーズの選択

優先順位を付ける:

• 迅速な処理;

• RNase フリーの製造と取り扱い。

• 必要な RNA サイズ範囲の回収。

• ゲノム DNA の除去;

• 還元試薬およびカオトロピック試薬との適合性。

ウイルス RNA 用のビーズの選択

優先順位を付ける:

• 低入力回復。

• 高い捕獲効率。

• 阻害剤の除去;

• 少量の溶出。

• RT-qPCRとの互換性。

総核酸用のビーズの選択

全核酸法では、DNA と RNA の両方を一貫して回収する必要があります。

ゲノム DNA について検証されたビーズが、低分子 RNA、断片化したウイルス RNA、およびゲノム DNA を同じ効率で自動的に回収するとは考えないでください。

サンプルの種類ごとにビーズを選択する方法

全血

全血には次のものが含まれています。

• 細胞;

• 血漿タンパク質;

• ヘム;

• 脂質;

• 抗凝固剤。

以下を提供するビーズを選択してください。

• 粘稠なライセート中での強い磁気反応。

• 効率的な再分散。

• 適切なゲノム DNA 容量。

• タンパク質キャリーオーバーが低い。

• プロテイナーゼ K およびカオトロピック塩との適合性。

さまざまな血液投入量とヘマトクリットレベルをテストします。

血漿と血清

血漿および血清には通常、低濃度の無細胞核酸と高濃度のタンパク質が含まれています。

優先順位を付ける:

• 低いコピー数で高い回収率。

• 短いフラグメントの効率的なキャプチャ。

• 非特異的損失が少ない。

• 溶出量が少ない。

• 最小限のビーズキャリーオーバー。

Thermo Fisher は、自社の cfDNA ワークフローについて、最適化されたシリカ様ビーズ化学反応と低容量溶出を使用して、無細胞サンプルから低濃度の循環核酸を回収すると説明しています。

ウイルススワブと輸送媒体

綿棒およびウイルス輸送媒体には以下が含まれる場合があります。

• 粘液;

• タンパク質;

• 塩;

• 抗生物質;

• 化学物質を不活化する。

• 低コピーのウイルス核酸。

優先順位を付ける:

• ウイルスの RNA および DNA の回収。

• トランスポートメディアとの互換性。

• RT-PCR阻害剤の除去。

• 高速抽出。

• オートメーションの互換性。

さまざまなトランスポート メディア ブランドを検証に含める必要があります。

細胞と動物組織

細胞と組織は十分な溶解とタンパク質消化を必要とします。

ビーズの選択には次の点を考慮する必要があります。

• 組織投入質量;

• DNA または RNA ターゲット。

• サンプルの粘度;

• プロテイナーゼ K 消化。

• 均質化方法；

• 高分子量 DNA の要件。

不完全な組織溶解は、ビーズの量を増やすだけでは修正できません。

植物組織

植物サンプルには次のものが含まれる場合があります。

• 多糖類;

• ポリフェノール;

• 顔料;

• セルロース;

• 二次代謝物。

次のようなビーズとバッファーの組み合わせを選択します。

• 強い植物溶解化学反応に耐えます。

• ポリフェノールと多糖類を除去します。

• 粘性物質内の磁気収集を維持します。

• PCR に適合する核酸を生成します。

ビーズの選択は、阻害剤除去化学反応とともに実行する必要があります。

細菌と真菌

微生物サンプルには以下が必要になる場合があります。

• 酵素による細胞壁消化。

• 機械的破壊。

• 熱処理;

• ビーズ叩き。

細菌のゲノム DNA の場合、ワークフローで高分子量 DNA を保存する必要があるかどうかを検討してください。

真菌サンプルの場合は、多糖類と色素の除去をテストします。

便、土壌、食品サンプル

これらのマトリックスには高レベルの PCR 阻害剤が含まれる場合があります。

例としては次のものが挙げられます。

• 胆汁酸塩;

• フミン酸;

• 多糖類;

• 脂肪;

• 複合タンパク質;

• 加工添加剤。

最大の生収量よりも精製パフォーマンスを優先します。

阻害剤を含む高収量よりも、より良好な増幅能を備えたわずかに低収量の方が好ましい場合があります。

FFPEサンプル

ホルマリン固定パラフィン包埋材料には、次のような課題があります。

• 架橋タンパク質;

• 断片化された核酸。

• 化学修飾;

• 回収可能量が少ない。

• パラフィン汚染。

優先順位を付ける:

• 短い断片の回復。

• 強力な不純物除去。

• 少量の溶出。

• 低入力時の再現性。

ビーズは、脱パラフィン、脱架橋、および消化のステップとともに検証する必要があります。

無細胞 DNA

cfDNA は通常、低濃度で存在し、主に短い断片で構成されています。

優先順位を付ける:

• 有効表面積が大きい。

• 効率的な短いフラグメントのキャプチャ。

• 低損失の液体ハンドリング。

• 少量の溶出。

• 高い再現性。

• 大プラズマ入力に対応。

物理的なサイズだけで cfDNA ビーズを選択しないでください。緩衝液の化学反応と抽出アーキテクチャも同様に重要です。

核酸フラグメントのサイズがビーズの選択に与える影響

フラグメントのサイズは、吸着反応速度、回収および溶出に影響します。

高分子量DNA

長い DNA の場合、以下を評価します。

• 穏やかな溶解。

• 穏やかに混合します。

• 低せん断転写。

• 完全な溶出。

• ワイドボアピペットチップ。

• 最小限の渦巻き。

ワークフローが機械的に激しい場合、高効率のビーズでも断片化された DNA が生成される可能性があります。

標準ゲノム DNA

日常的な PCR およびジェノタイピングのワークフローでは通常、以下が優先されます。

• 収率;

• 純度;

• 一貫性;

• 阻害剤の除去。

短い DNA 断片

結合条件が十分に強くない場合、またはビーズとバッファーの組み合わせがより長い DNA に有利な場合、短いフラグメントが失われる可能性があります。

低分子RNAと断片化RNA

Small RNA の回収は、実際のフラグメント分布を使用して検証する必要があります。

total RNA の主張は、必ずしも効率的な microRNA の回収を保証するものではありません。

cfDNA

cfDNA 抽出では、比較的大量のサンプルから少量の短い断片を効率的に回収する必要があります。

サンプル固有の抽出システムは、最適化されたシリカ様表面と少量の溶出を使用して、これらのターゲットを濃縮します。

手動抽出用のビーズの選び方

手動抽出の場合は、次のことを優先します。

• 簡単な目視検査。

• 標準の磁気ラックで確実に収集。

• ピペットの取り扱いが良好。

• ビーズのキャリーオーバーが少ない。

• ペレットの再分散が容易。

• 小さなタイミングの変動を許容します。

複数のオペレーターを使用してワークフローを評価します。

手動テストでは次のことを判断する必要があります。

• 結合時間。

• 混合方法；

• 磁気収集時間。

• 洗濯サイクル。

• 乾燥時間。

• 溶出時間と温度。

堅牢な手動手法は、自動化する前の参照ワークフローとして役立ちます。

自動抽出用のビーズの選び方

自動抽出には追加の要件が課されます。

ビーズは以下をサポートする必要があります。

• 一貫した自動分注。

• 迅速な磁気固定化。

• 予測可能な再懸濁。

• 限られた沈下。

• 繰り返しの洗濯サイクル。

• クロスウェルキャリーオーバーが低い。

• プレート全体にわたって安定したパフォーマンス。

プロメガは、混合が自動抽出の問題の最も一般的な原因の 1 つであると認識しています。溶液の粘度、液体の混和性、ビーズのサイズ、ビーズの密度はすべて、自動混合の効率に影響します。

自動分注の評価

以下のビーズ濃度をテストします。

• 最初の井戸。

• 真ん中の井戸。

• 最後の井戸。

• さまざまなプレート。

• 分注実行中のさまざまなポイント。

磁気収集の評価

測定：

• 収集時間。

• 上清中にビーズが残っている。

• ビードの損失。

• 吸引クリアランス。

• 溶出液へのキャリーオーバー。

混合の評価

以下の際に、機器がビーズを完全に再懸濁するかどうかを確認します。

• バインディング;

• 洗浄;

• 溶出。

磁気ロッド システム vs 液体ハンドリング ワークステーション

磁気ロッドシステム

磁気ロッドまたは粒子移動装置が試薬ウェル間でビーズを移動させます。

優先順位を付ける:

• 強力な磁気収集。

• ロッドカバーからの確実なリリース。

• ビーズの再分散性が良好。

• 繰り返しの転写に対する耐性。

• 残留ビーズの保持力が低い。

液体ハンドリングワークステーション

液体を追加したり除去したりする間、ビーズは容器内に残ります。

優先順位を付ける:

• 側壁またはリング磁石による迅速な収集。

• 吸引損失が少ない。

• 分注中の安定した懸濁液。

• ピペット混合との互換性。

• ビードキャリーオーバーが少ない。

磁石の形状は、ビーズ ペレットの位置と安全に吸引できる量に影響します。プロメガは、リング磁石とポスト磁石が異なるビーズ収集パターンを生み出し、異なる溶出または吸引戦略が必要になる可能性があると指摘しています。

ビーズと結合緩衝液および洗浄緩衝液を一致させる方法

シリカビーズはバッファーシステムから独立して評価してはなりません。

シリカベースの抽出では通常、制御されたイオン条件が使用されます。核酸は高塩またはカオトロピック条件で結合し、低塩条件で放出されます。

バインディングバッファ変数

重要なパラメータには次のものがあります。

• カオトロピック塩タイプ。

• 塩分濃度;

• pH;

• アルコール濃度;

• 洗剤;

• サンプル対バッファー比。

• 拘束時間。

洗浄バッファーの変数

洗浄バッファーは以下を除去する必要があります。

• タンパク質;

• 洗剤;

• カオトロピック塩;

• サンプル阻害剤;

• 脂質;

• 顔料。

また、洗浄中に核酸の結合を維持する必要があります。

溶出変数

溶出は以下に依存します。

• 緩衝イオン強度。

• pH;

• 音量;

• 温度;

• インキュベーション;

• 混合。

最近のシリカビーズ抽出研究では、結合 pH、ビーズの動き、結合時間、溶出 pH、温度、溶出時間のすべてが最終的な核酸収量に影響を与えることがわかりました。

したがって、ビーズのサプライヤーを変更すると、以下の再最適化が必要になる場合があります。

• バインディングバッファーボリューム。

• ビーズの量;

• 磁気時間。

• 洗濯サイクル。

• 乾燥;

• 溶出。

シリカ磁気ビーズ vs カルボキシル磁気ビーズ

シリカおよびカルボキシル磁気ビーズは、さまざまなタイプの核酸ワークフローで使用されます。

市販の製剤はさまざまであるため、この区分は絶対的なものではありません。

ただし、シリカコーティングされた磁性粒子は複雑な生体サンプルから核酸を抽出するために一般的に使用され、カルボキシル化 SPRI タイプのビーズは PCR クリーンアップや NGS ライブラリーの精製に広く使用されます。

バッファー システム全体を再最適化することなく、ある表面を別の表面に置き換えないでください。

候補ビーズの評価方法

有用なスクリーニングプログラムには、可能な限り少なくとも 3 つの候補ビーズが含まれている必要があります。

ステージ 1: 物理的評価

測定：

• 粒子サイズ;

• サイズ分布。

• 固形分濃度;

• 磁気収集時間。

• 沈降;

• 再分散性。

• 分離後の残留ビーズ。

ステージ 2: 結合の評価

精製した DNA または RNA を使用して以下を比較します。

• 結合能力;

• 結合速度。

• 回復;

• 溶出効率;

• フラグメントサイズのリカバリ。

ステージ 3: マトリックスの評価

実際のサンプルタイプをテストします。

比較する：

• 収率;

• 純度;

• 増幅性。

• 阻害剤の除去;

• 精度。

ステージ 4: 自動化の評価

評価する：

• 塗布の一貫性。

• プレートの均一性。

• 磁気収集;

• 混合;

• ビーズキャリーオーバー。

• 相互汚染。

ステージ 5: 安定性評価

テスト：

• リアルタイムストレージ。

• ストレージの高速化。

• 関連する場合は暴露を凍結する。

• 輸送シミュレーション。

• オープンボトルの安定性。

• 混合を繰り返しました。

推奨されるパフォーマンス テスト

単一の測定値を単独で使用しないでください。

たとえば、残留塩または他の化合物が光を吸収する場合、UV 吸光度は核酸濃度を過大評価する可能性があります。機能的 qPCR またはシーケンスのパフォーマンスは、使用可能な抽出品質のより直接的な証拠を提供します。

よくある選択の間違い

粒径だけで選ぶ

同じ公称サイズの 2 つのビーズは、次の点で異なる場合があります。

• 磁気コンテンツ。

• シリカコーティング;

• 表面積;

• サイズ分布。

• サスペンションの安定性。

• バインディング性能。

最高の結合容量を選択する

非常に高い容量は不要な場合があり、低入力サンプルからの回収率が向上しない可能性があります。

磁気選別機の互換性を無視する

ある磁石ではうまく機能するビーズでも、別の磁石ではゆっくりと、または不均一に収集される場合があります。

沈降を無視する

沈降の早いビーズは、自動分注中に大きな濃度変動を引き起こす可能性があります。

精製された DNA のみを検査する

精製核酸の性能は、血液、便、植物、または FFPE サンプルからの不純物の除去を予測するものではありません。

増幅性を考慮しない収量の評価

高収量の溶出液には PCR 阻害剤が含まれる場合があります。

DNA と RNA の性能が同一であると仮定すると

核酸の種類とフラグメントのサイズが異なる場合は、個別の検証が必要です。

バッファーを再最適化せずにビーズを変更する

ビーズとバッファーは統合システムを形成します。直接置換すると、結合、洗浄、溶出が変化する可能性があります。

商用仕様の無視

研究サンプルが成功しても、以下がなければ商業生産には不十分です。

• バッチ仕様。

• スケールアップデータ。

• 制御を変更します。

• 供給の継続性。

磁気ビーズ交換後のトラブルシューティング

トラブルシューティング中は、一度に 1 つの変数を変更します。

メーカーとサプライヤーを比較する方法

サプライヤーを 4 つの分野で評価します。

製品の機能

確認する：

• 利用可能な粒子サイズ;

• カスタムサイズ機能。

• 固形分濃度;

• 表面化学;

• 磁気応答。

• アプリケーションデータ。

品質能力

リクエスト：

• 分析証明書;

• 安全データシート;

• 粒子サイズレポート。

• 磁気性能データ。

• バッチトレーサビリティ。

• 安定性に関する情報。

• 品質システムの文書化。

商用能力

確認する：

• サンプルの入手可能性;

• パイロット注文数量。

• 商業能力;

• リードタイム;

• 安全在庫。

• 予約済みのロット。

• 梱包オプション。

技術力

サプライヤーが以下をサポートできるかどうかを尋ねます。

• ビーズのスクリーニング。

• バッファの互換性。

• 自動化転送;

• トラブルシューティング;

• カスタム開発。

• スケールアップ調査。

研究依頼には販売代理店が適している場合があります。一般に、OEM 開発、カスタム粒子、品質契約、商用供給には直接メーカーが望ましいです。

標準シリカ磁気ビーズとカスタム シリカ磁気ビーズ

通常、標準製品は以下を提供するため、出発点として最適です。

• サンプリングの高速化。

• 既存の仕様。

• 開発コストの削減。

• リードタイムの​​短縮。

• より簡単な比較。

カスタム磁気ビーズは、プロジェクトで次のことが必要な場合に適しています。

• 標準外の粒子サイズ。

• より速い磁気応答。

• 沈下を軽減。

• 異なるシリカの厚さ。

• 固形分濃度が高いか低いか。

• カスタムストレージバッファ。

• 特定の包装;

• 独自のエクストラクターとの互換性。

カスタム プロジェクトを開始する前に、測定可能な受け入れ基準を定義します。

例としては次のものが挙げられます。

• 指定された時間内に収集します。

• 最小限の DNA 回収。

• 最大ビーズキャリーオーバー。

• 最大 Ct 変動。

• 定義された粒径範囲。

• 必要な保存期間。

RFQ に含める情報

シリカ磁気ビーズの完全な RFQ には以下が含まれている必要があります。

1. 標的核酸;

2. サンプルの種類;

3. サンプル入力量。

4. 予想される核酸濃度。

5. 必要なフラグメントサイズの範囲。

6. 手動または自動抽出。

7. 抽出器具;

8. 磁気ロッドまたは液体ハンドラー形式。

9. チューブタイプまたはプレートタイプ。

10. 必要なスループット。

11. ターゲット粒子サイズ（既知の場合）。

12. 必要な磁気収集時間。

13. 必要な結合容量。

14. ビーズ濃度;

15. 結合バッファーの化学。

16. 洗浄緩衝液の化学的性質。

17. 溶出量;

18. 下流アッセイ。

19. 必要な回復。

20. 必要な純度。

21. 最大ビーズキャリーオーバー。

22. サンプル量;

23. パイロット注文数量。

24. 年間推定量。

25. 梱包要件;

26. 必要な品質文書。

27. 有効期限の目標。

28. ロット予約の要件。

29. 変更通知の要件。

30. OEM またはプライベート ラベルの要件。

この情報を提供することで、メーカーは直径のみに基づいた要求よりも適切な粒子を推奨できるようになります。

よくある質問

最適なシリカ磁気ビーズのサイズはどれくらいですか?

普遍的な最適なサイズはありません。粒子が小さいほど表面積が大きくなり、粒子が大きいほど早く収集され、扱いやすくなります。正しいサイズは、サンプル、バッ​​ファー、磁石、自動化プラットフォームによって異なります。

DNA 抽出には小さい磁気ビーズの方が適していますか?

いつもではありません。ビーズが小さいほど表面積は大きくなりますが、分離が遅くなり、キャリーオーバーが増加する可能性があります。

RNA 抽出用のビーズはどのように選択すればよいですか?

効率的な低投入量の回収、RNase フリーの処理、適切な RNA サイズの回収、カオトロピック試薬や還元試薬との適合性を優先します。

同じビーズで DNA と RNA を抽出できますか?

はい、シリカビーズは DNA と RNA の両方に結合できます。選択性は緩衝系、サンプル前処理、酵素処理によって異なります。

ウイルス RNA にはどのビーズが最適ですか?

低いコピー数で高い回収率、阻害剤の除去、迅速な自動化、少量の溶出を実現するビーズを選択してください。

ゲノム DNA にはどのビーズが最適ですか?

十分な容量、効率的なタンパク質除去、良好な溶出、および目的の DNA 長に適した取り扱い条件を備えたビーズを選択してください。

cfDNA にはどのビーズが最適ですか?

短く、存在量の少ないフラグメントの回収、大量の血漿量との適合性、および少量の溶出を優先します。

結合能力とは何ですか?

結合能力は、特定の条件下で捕捉できる核酸の量です。常に緩衝液、核酸の種類、測定方法とともに報告する必要があります。

結合能力が最も高いほど常に最適なのでしょうか?

いいえ。理論上の最大容量よりも実際の回収、不純物の除去、溶出効率の方が重要です。

ビーズはどれくらいの速さで磁石に集まりますか?

許容可能な時間はワークフローとマグネットによって異なります。目的のチューブ、プレート、容量、およびバッファーで測定する必要があります。

なぜ磁性ビーズが沈着するのですか?

高密度の磁性材料が含まれています。粒子サイズ、密度、濃度、懸濁液の配合は沈降に影響します。

なぜ再分散性が重要なのでしょうか?

結合、洗浄、および溶出には、ビーズが液体と効率的に接触する必要があります。再分散が不十分な場合、収率と純度が低下します。

ビーズはどのような抽出器具にも使用できますか?

自動的ではありません。磁石の形状、混合、容器の形式、および液体の取り扱いは機器によって異なります。

ビーズのサプライヤーを変更する場合、バッファーを変更する必要がありますか?

おそらく。シリカ表面と粒子の設計が異なると、結合、洗浄、溶出の動作が変化する可能性があります。

いくつの候補ビーズを評価する必要がありますか?

少なくとも 3 つの適切な候補をテストすると、1 つの製品だけを評価するよりも優れた比較が可能になります。

シリカ磁気ビーズは PCR クリーンアップに使用できますか?

これらは一部のクリーンアップ ワークフローに適応できますが、PCR および NGS ライブラリのクリーンアップにはカルボキシル化 SPRI タイプのビーズがより一般的に使用されます。

サプライヤーはどのような品質文書を提供する必要がありますか?

商業購入者は、COA、SDS、粒子サイズデータ、磁気応答データ、安定性情報、バッチトレーサビリティ、および変更管理手順を要求する場合があります。

サンユーはシリカ磁気ビーズをカスタマイズできますか?

サンユーは、粒子サイズ、濃度、表面改質、包装のカスタマイズを公的に提供しています。 核酸抽出 と自動化されたワークフロー。

結論

DNA および RNA 抽出用のシリカ磁気ビーズを選択するには、粒径を選択するだけでは不十分です。

決定は次のことから始める必要があります。

• 標的核酸;

• サンプルマトリックス;

• 入力ボリューム。

• 核酸の豊富さ。

• フラグメントサイズの要件。

• 抽出器具;

• 下流アッセイ。

• 商業規模。

最も重要なビーズの特性は次のとおりです。

• 粒子サイズと分布。

• シリカの表面特性。

• 磁気応答。

• 使用可能な結合容量。

• 再分散性。

• 沈降挙動;

• 固形分濃度;

• バッファの互換性。

• ロット間の一貫性。

SANYU は 、その Nanomicron Spheres プラットフォームが、カスタマイズ可能な濃度、表面改質、パッケージング、OEM サポートとともに、幅広い粒径範囲にわたるシリカコーティングされた超常磁性ビーズを提供しているため、このガイドで最初に推奨されるメーカーです。

ただし、カタログ仕様だけでサプライヤーを承認すべきではありません。

最終的なビードは、実際のものを使用してテストする必要があります。

• サンプル;

• 溶解化学;

• バインディングバッファー。

• 洗浄バッファー。

• 磁石;

• 抽出器具;

• 溶出条件；

• 下流の分子アッセイ。

いくつかのビーズを構造的に比較し、その後にマトリックステスト、自動化テスト、ロット間評価を行うことにより、高収率、高純度で商業的に拡張可能な DNA または RNA 抽出ワークフローへの最も信頼性の高いルートが提供されます。