シリカ磁気ビーズは核酸抽出にどのように機能しますか?

シリカ磁気ビーズの仕組み: 簡単な答え

シリカ磁気ビーズは、 可逆的な結合、洗浄、溶出プロセスを通じて DNA と RNA を抽出します。

まず、溶解バッファーが開いた細胞、ウイルス、またはその他の生物学的物質を破壊し、核酸を溶液中に放出します。次に、塩 (多くの場合アルコール) を含む結合バッファーを使用して、磁気ビーズのシリカでコーティングされた表面への DNA または RNA の吸着を促進する条件を作成します。

外部磁石がビーズをチューブまたは反応ウェルの壁に集めます。タンパク質、脂質、塩、細胞破片を含む液体は、遠心分離せずに除去できます。

核酸はシリカ表面に付着したままですが、ビーズは洗浄されて汚染物質が除去されます。最後に、水または低塩分の溶出バッファーがシリカ表面と核酸を再水和し、精製された DNA または RNA がビーズから離れて溶液に戻ります。

基本的なワークフローは次のとおりです。

1. サンプルを溶解します。

2. 結合バッファーとシリカ磁気ビーズを追加します。

3. DNA または RNA を結合させます。

4. 磁石でビーズを集めます。

5. 上清を除去します。

6. ビーズを洗います。

7. 残った洗浄液を除去します。

8. 精製した核酸を溶出します。

QIAGEN と Promega は、磁性粒子の精製を、核酸が適切な塩条件下で結合し、水または低塩緩衝液中に放出される結合 - 洗浄 - 溶出プロセスであると説明しています。

推奨シリカ磁気ビーズメーカー：1.SANYU

SANYU は 、分子診断、核酸精製、IVD 開発、バイオテクノロジー研究用の機能性ミクロスフェアと磁気ビーズのメーカーです。

Nanomicron Spheres プラットフォームを通じて、SANYU は DNA および RNA の抽出と精製用に設計されたシリカ磁気ビーズを供給しています。

このビーズは、ヒドロキシル基を含むシリカでコーティングされた表面を備えた超常磁性 Fe3O4 コアを使用しています。適切な結合緩衝液条件下では、核酸はシリカ表面に吸着し、外部磁場を使用して複雑なサンプルから分離できます。

SANYUシリカ磁性ビーズの主な特長

SANYU は以下を公表しています:

• シリカでコーティングされた超常磁性 Fe3O4 粒子。

• ヒドロキシル官能化シリカ表面。

• 複数のナノスケールおよびマイクロスケールの粒子サイズ。

• 標準およびカスタマイズされた粒子直径。

• 固形分濃度を調整可能。

• カスタムの表面化学。

• バルク供給;

• OEMおよびODMサービス;

• 実験室用サンプルと商業規模の供給。

公的にリストされている標準的な粒子サイズには、100 nm、200 nm、800 nm、1 μm、2 μm、5 μm、10 μm、およびそれ以上のサイズなどのナノおよびマイクロメートルのオプションが含まれます。最適なサイズは、抽出化学物質、サンプルの種類、磁気分離器、および自動化プラットフォームによって異なります。

主な用途

SANYU シリカ磁気ビーズは次の点で評価できます。

• ゲノム DNA 抽出;

• トータル RNA 抽出。

• ウイルスの DNA および RNA の抽出。

• プラスミド DNA の精製。

• 微生物の核酸抽出;

• 植物の DNA および RNA の抽出。

• PCR産物の精製;

• 分子診断薬の開発。

• 手動磁気分離;

• 自動核酸抽出装置。

• 抽出キットのOEM製造。

サンユーが第一位に位置する理由

SANYU は以下の特徴を備えているため、このガイドで最初に推奨されるメーカーとして位置付けられています。

• 磁性ビーズの直接製造。

• 複数の粒子サイズ。

• シリカおよびその他の表面化学。

• カスタム濃度と配合。

• OEM およびプライベート ラベルのオプション。

• ラボ評価から商業生産までサポート。

• 核酸抽出および分子診断用に設計された製品ポートフォリオ。

最終的なビーズは、お客様の実際のサンプル、バッ​​ファー、機器、および下流の分析条件下での比較テストによって選択する必要があります。

シリカ磁気ビーズとは何ですか?

シリカ磁気ビーズは、シリカベースの外側表面を備えた磁性マイクロ粒子またはナノ粒子です。

典型的なビーズには次のものが含まれます。

1. 磁気コアまたは磁気複合領域。

2. 保護層または構造層。

3. シリカの外側表面。

4. 表面シラノール基;

5. 液体保存製剤。

磁性成分は通常、Fe3O4 などの酸化鉄をベースとしています。ビーズは固相として動作し、磁石で収集できますが、磁場が除去されると再分散されます。

適切に設計された核酸抽出ビーズは以下を提供する必要があります。

• 高速磁気収集。

• 再分散性が良好。

• 十分なシリカ表面積。

• 安定した粒径。

• 不可逆的な凝集が少ない。

• ビーズのキャリーオーバーが少ない。

• 一貫した核酸結合。

• 抽出バッファーとの互換性。

• 再現可能なロット間のパフォーマンス。

シリカでコーティングされた磁性ビーズは、シリカの核酸結合挙動と磁性粒子の便利な取り扱いを組み合わせています。 QIAGEN は、この組み合わせにより遠心分離や真空処理の必要性がなくなり、自動化に容易に適応できると述べています。

シリカ被覆磁性ビーズの構造

シリカ磁気ビーズの構造はメーカーによって異なる場合があります。

磁心

磁気コンポーネントにより、粒子は外部磁場に応答できます。

超常磁性粒子は磁石の存在下では強い磁性を持ちますが、磁場が取り除かれた後は永久磁化をほとんど保持しません。

この動作はビーズにとって次のことに役立ちます。

• 磁気分離中に迅速に収集します。

• 磁石を取り外した後、再分散してください。

• 永久磁化されたままにならないようにしてください。

• 不可逆的なビーズ間の引力を軽減します。

シリカコーティング

シリカコーティングは、核酸の吸着に使用される表面を提供します。

シリカは二酸化ケイ素であり、その水和表面にはシラノール基が含まれています。これらの基は、慎重に制御された緩衝液条件下で核酸と相互作用します。

表面水酸基

シリカ表面にはヒドロキシル含有シラノール基が含まれています。

これらの基は、核酸とシリカ表面の間の可逆的相互作用に関与します。

相互作用は次の影響を強く受けます。

• pH;

• イオン強度;

• ソルトタイプ。

• アルコール濃度;

• 水分活性;

• 温度;

• 表面積;

• 核酸の長さと構造。

懸濁液配合

市販のシリカ磁気ビーズは通常、水性懸濁液として供給されます。

製剤には以下が含まれる場合があります。

• 水;

• バッファ;

• スタビライザー;

• 界面活性剤;

• 防腐剤;

• 塩。

これらの添加剤は、磁気分離、ビーズの再分散、核酸の結合、および下流の抽出試薬との適合性に影響を与える可能性があります。

DNA と RNA はなぜシリカに結合するのでしょうか?

DNA、RNA、シリカの表面は一般に、多くの抽出条件下で負に帯電します。

最初は、同様に帯電した表面は互いに反発するため、吸着が起こりそうにないように見えます。

ただし、適切な結合バッファーは化学環境を変化させます。高濃度のカオトロピック塩、その他の塩、アルコールは水和を減少させ、静電反発を遮蔽する可能性があります。これにより、核酸とシリカ表面との間に短距離相互作用が形成されることが可能になります。

研究によると、吸着には以下の組み合わせが関与する可能性があります。

• 脱水;

• 静電シールド。

• カチオン媒介塩橋。

• 水素結合。

• イオン相互作用;

• 表面効果と溶剤効果。

各相互作用の正確な寄与は、抽出化学によって異なります。したがって、結合メカニズムは 1 つの単純な永久化学結合として説明されるべきではありません。

シラノール基の役割

含水シリカの表面にはシラノール基が含まれています。

通常の水性条件下では、シリカ表面と核酸のリン酸骨格の両方がマイナス電荷を帯びている可能性があります。水分子も両方の表面の周りに水和層を形成します。

これらの水和層と静電反発により、強い吸着が防止されます。

結合バッファーはこの環境を変化させ、シリカ表面と核酸の間のより緊密な接触を可能にします。

カオトロピック塩の役割

カオトロピック塩は、シリカベースの核酸抽出に一般的に使用されます。

例としては、配合物に応じて、グアニジニウム塩が挙げられる。

カオトロピック剤はいくつかの目的に役立ちます。

• 細胞やウイルス粒子の破壊を助けます。

• タンパク質を変性させる。

• ヌクレアーゼ活性を低下させます。

• 構造化された水を破壊します。

• 核酸とシリカの周囲の水和を減らします。

• 固相への核酸の吸着を促進します。

プロメガは、高濃度のカオトロピック塩がシリカ結合化学の重要な部分であることを特定しています。その精製ガイドでは、DNA は高塩分条件下ではシリカに結合し、アルコールを含む洗浄中には付着したままとなり、低塩分条件下では放出されると説明されています。

脱水と静電気シールド

核酸とシリカは水中で強く水和されます。

結合バッファーは、これらの水和層の安定性を低下させます。塩は、シリカ表面および核酸主鎖上の負電荷をスクリーニングすることもできます。

カチオンは、負に帯電した表面の橋渡しに役立つ可能性がありますが、水和が減少すると、水素結合やその他の短距離相互作用がより有利になります。

プロセスは次の影響を受けます。

• 塩分濃度;

• カチオン型。

• pH;

• アルコール含有量;

• 温度;

• 表面化学。

バインディングが可逆である理由

相互作用は周囲のソリューションに依存するため、可逆的です。

高塩分で水分活性が低下した条件下では、核酸の吸着が促進されます。

ビーズを水または低塩緩衝液に入れると、次のようになります。

• 塩分濃度が減少します。

• 表面は再水和されます。

• 静電反発力が増加します。

• 核酸は再び可溶性になります。

• DNA または RNA がシリカから剥がれます。

この可逆的な変化により、結合、洗浄、溶出のワークフローが可能になります。

完全な核酸抽出ワークフロー

ステップ 1: サンプルの溶解

最初のステップは、生体サンプルから DNA または RNA を放出することです。

サンプルに応じて、溶解には以下が含まれる場合があります。

• 洗剤;

• カオトロピック塩;

• プロテイナーゼK;

• 還元剤;

• 機械的破壊。

• 加熱;

• 酵素消化;

• ビーズ叩き。

溶解の目的は次のとおりです。

• 細胞膜を破壊します。

• ウイルスのエンベロープまたはカプシドを破壊します。

• 核酸を放出します。

• タンパク質を変性させる。

• ヌクレアーゼを不活化します。

• 可能な場合はサンプルの粘度を下げます。

不完全な溶解は、抽出収率が低い一般的な原因です。

溶解方法はサンプルに適応させる必要があります。全血、植物組織、便、細菌細胞、およびウイルス輸送媒体では、破壊および阻害剤除去の要件が大きく異なります。

ステップ 2: バインド条件を作成する

溶解後、結合バッファーが追加されるか、溶解バッファー自体が必要な条件を作成します。

バインディング システムには以下が含まれる場合があります。

• カオトロピック塩;

• 追加の塩。

• アルコール;

• 緩衝剤;

• 洗剤;

• pH調整剤。

緩衝液は、標的核酸を抽出可能な形態に維持しながら、核酸の吸着を促進する必要があります。

結合剤の濃度が不十分であると、DNA または RNA が上清に残る可能性があります。

過度に過酷な条件は、核酸の完全性に影響を与えたり、下流の塩の除去を複雑にしたりする可能性があります。

ステップ 3: 核酸をビーズに結合する

シリカ磁気ビーズは結合条件下でライセートと混合されます。

核酸分子はビーズ表面に接触する必要があるため、効率的な混合が不可欠です。

混合は次の方法で実行できます。

• ピペッティング。

• ボルテックス;

• 軌道の揺れ。

• 回転中。

• 磁性ロッド混合。

• 自動ピペット混合。

ビーズは結合ステップ全体にわたって十分に分散したままでなければなりません。

ビーズが粘性のあるサンプル材料に沈降、凝集、または捕捉されたままの場合、利用可能な結合表面が減少し、回収率が低下する可能性があります。

プロメガは、特に粘性のあるサンプルや不純物が豊富なサンプルでは、​​ビーズの分散が不十分で混合が不十分な場合、抽出性能が低下する可能性があると指摘しています。

ステップ 4: 磁石でビーズを集める

結合後、磁場によってビーズがチューブまたはウェルの側面または底部に引き寄せられます。

核酸はシリカ表面に吸着されているため、ビーズとともに移動します。

周囲の液体には、次のような多くの非結合物質が含まれています。

• タンパク質;

• 脂質;

• 洗剤;

• 細胞破片。

• 顔料;

• 多糖類;

• 過剰な塩分。

• その他の可溶性汚染物質。

ビーズが完全に収集されたら、上清を除去します。

磁化時間は以下によって異なります。

• 粒子サイズ;

• 磁気コンテンツ。

• サンプルの粘度;

• 液体の量。

• 磁石の強さ。

• 磁石の形状。

• 器の形。

ビーズが完全に収集される前に液体を除去すると、ビーズの損失が発生し、核酸の回収率が低下する可能性があります。

ステップ 5: 汚染物質を洗い流す

ビーズと核酸の複合体は 1 回以上洗浄されます。

洗浄バッファーにはアルコールと塩が含まれることがよくあります。これらの条件は、汚染物質を除去しながら、核酸をシリカに付着させたままにするのに役立ちます。

洗浄ステップにより以下のものが除去される可能性があります。

• タンパク質;

• 洗剤;

• 細胞破片。

• 顔料;

• 脂質;

• カオトロピック塩;

• PCR阻害剤;

• 不要な小分子。

洗浄のたびに効率的なビーズの再分散が必要です。

ビーズペレットを完全に再懸濁せずに洗浄バッファーを追加するだけでは、ビーズ凝集体内に汚染物質が閉じ込められたままになる可能性があります。

プロメガは、磁性粒子は洗浄中に完全に再懸濁できるため、固定固相と比較して汚染物質の除去が向上すると説明しています。

ステップ 6: 残留アルコールを除去する

最終洗浄後、溶出前に残留アルコールを除去する必要があります。

アルコールのキャリーオーバーは以下を阻害する可能性があります。

• PCR;

• RT-PCR;

• 酵素消化。

• 結紮;

• 逆転写。

• シーケンスライブラリの準備。

ただし、過度の乾燥も問題を引き起こす可能性があります。

ビーズが乾燥しすぎると再懸濁が難しくなり、結合した核酸の再水和と溶出が難しくなる場合があります。

プロメガは、不十分な乾燥と過度の乾燥の両方が、抽出性能が低下する一般的な原因であると特定しています。

最適な乾燥時間は、ビーズのタイプ、容器、洗浄量、温度、自動化プラットフォームに応じて決定する必要があります。

ステップ 7: 精製された DNA または RNA を溶出する

洗浄したビーズに水または低イオン強度の緩衝液を加えます。

一般的な溶出ソリューションには次のものがあります。

• ヌクレアーゼフリーの水。

• トリスバッファー。

• 低EDTA TEバッファー。

• アプリケーション固有の溶出バッファー。

低塩分環境はシリカ表面と核酸を再水和し、それらの相互作用を弱めます。

混合すると、DNA または RNA が放出されやすくなります。

溶出後:

1. ビーズは再び磁気的に収集されます。

2. 精製された核酸は液体中に残ります。

3. 溶出液は清潔なチューブまたはプレートに移されます。

以下を使用すると溶出パフォーマンスが向上する可能性があります。

• インキュベーションが長くなる。

• 穏やかに混合します。

• 適度な加熱。

• 適切なpH;

• 溶出量が多くなる。

体積が少ないほど、より濃縮された溶出液が得られますが、総回収率が低下する可能性があります。

各試薬の役割

正確な配合は抽出システムによって異なります。試薬濃度はサンプルの種類と目的の核酸に合わせて最適化する必要があります。

シリカ磁気ビーズは配列特異的ですか?

いいえ。標準的なシリカ磁気ビーズは配列特異的ではありません。

これらは一般に、特定の DNA または RNA 配列の認識ではなく、シリカ表面との物理的および化学的相互作用に基づいて核酸に結合します。

したがって、彼らは以下を捕捉する可能性があります。

• ゲノム DNA;

• ウイルスDNA;

• プラスミド DNA;

• 総RNA;

• ウイルスRNA;

• 小さな核酸断片。

• 不要な核酸種。

選択性は主に以下によって制御されます。

• 溶解条件;

• 結合緩衝液の組成。

• pH;

• 塩分濃度;

• アルコール濃度;

• ビーズとサンプルの比率。

• 洗濯条件

• 酵素治療。

例えば：

• RNase は、精製された DNA が必要な場合に使用できます。

• 精製された RNA が必要な場合は、DNase を使用できます。

• フラグメント選択の化学反応により、結合する DNA サイズが変化する可能性があります。

• 配列特異的な捕捉には、未修飾のシリカ表面ではなく、プローブまたはアフィニティーリガンドが必要です。

したがって、シリカ結合は、配列特異的な認識ではなく、可逆的な条件依存の核酸吸着として説明するのが適切です。

DNA および RNA の回収に影響を与える要因

粒子サイズと表面積

粒子サイズは以下に影響します。

• 利用可能な表面積;

• 結合能力;

• 沈降;

• 再分散性。

• 磁気応答。

• ビーズキャリーオーバー。

• 自動化の動作。

一般に、粒子が小さいほど単位質量あたりの表面積が大きくなりますが、次のような場合があります。

• より長い磁気分離時間が必要です。

• 停止期間が長くなる。

• より容易に吸引できるようになります。

• 弱い磁石では集まりにくくなります。

ビーズが大きいと分離が早くなりますが、単位質量あたりの表面積が小さくなり、分注中にすぐに沈降する可能性があります。

最適なサイズはアプリケーションによって異なります。

磁性含有量と分離速度

磁気含有量を増やすと収集速度が向上しますが、磁気含有量は以下のバランスをとる必要があります。

• シリカの表面積。

• サスペンションの安定性。

• 粒子密度;

• 再分散性。

• 核酸結合能力。

非常に高密度のビーズは、自動分注中に急速に沈降する可能性があります。

ビーズの収集が遅いと、処理時間が長くなったり、吸引中にビーズが失われる可能性があります。

ビーズ対サンプル比

ビーズが少なすぎると、結合能力が不十分になる可能性があります。

ビーズが多すぎると次のような可能性があります。

• 試薬コストの増加。

• より多くの汚染物質を捕捉します。

• キャリーオーバーのリスクが増加します。

• より多くの洗浄バッファーが必要です。

• 溶出濃度を下げる。

• 複雑な自動液体ハンドリング。

必要な比率は以下によって異なります。

• 予想される核酸量;

• サンプル量;

• フラグメントのサイズ。

• 表面積;

• 結合バッファーの化学。

• サンプルの不純物。

pHとイオン強度

pH は以下に影響します。

• シリカの表面電荷。

• 核酸の電荷;

• シラノールのイオン化;

• 水素結合。

• 溶出効率。

イオン強度は静電遮蔽に影響し、吸着に影響を与える可能性があります。

最適結合 pH は最適溶出 pH とは異なる場合があります。

カオトロピック塩濃度

カオトロピック塩が不十分であると、結合が不完全になる可能性があります。

塩分が過剰に残留すると、次のような可能性があります。

• 純度を下げる。

• PCRを阻害します。

• 酵素活性に影響を与える;

• A260/A230 汚染が増加します。

• 洗浄が不十分な場合は、最終溶出液に残ります。

結合バッファーと洗浄プロセスは、1 つの統合システムとして開発する必要があります。

アルコール濃度

アルコールは核酸の吸着と汚染物質の除去をサポートします。

アルコールが少なすぎると結合が低下したり、洗浄中に核酸が失われる可能性があります。

残留アルコールが多すぎると、下流の反応が阻害される可能性があります。

アルコール濃度は以下を考慮する必要があります。

• サンプル量;

• 既存の液体組成物。

• バインディングバッファーボリューム。

• 蒸発;

• 自動化された分注精度。

混合および結合時間

混合が不十分であると、核酸とビーズ表面の接触が妨げられます。

過度に激しく混合すると、高分子量 DNA が切断される可能性があります。

重要な変数には次のものがあります。

• ピペッティング速度。

• 混合サイクルの数。

• シェーカー速度。

• 渦時間。

• 液体の粘度;

• 結合期間。

• 容器の形状。

高分子量のゲノム DNA の場合は、より穏やかな混合が必要な場合があります。

洗浄とビーズの乾燥

洗浄が不十分だと次のような汚れが残る可能性があります。

• タンパク質;

• 塩;

• 洗剤;

• エタノール可溶性汚染物質。

• PCR阻害剤。

結合条件が維持されない場合、過剰な洗浄により収率が低下する可能性があります。

乾燥が不十分だとアルコールが残ります。

過度の乾燥は溶出効率を低下させます。

溶出バッファー、容量、温度

溶出は再水和と核酸とシリカの相互作用の破壊に依存します。

重要な変数には次のものがあります。

• 緩衝液のpH。

• イオン強度;

• EDTA濃度;

• 溶出量;

• インキュベーション時間。

• 温度;

• 混合。

一部のワークフローでは適度な加熱で溶出を改善できますが、過剰な加熱は RNA の完全性や下流の要件に影響を与える可能性があります。

DNA 抽出と RNA 抽出

シリカ磁気ビーズは DNA と RNA の両方に使用できますが、ワークフローは必ずしも同じではありません。

RNA 抽出に関する考慮事項

RNA ワークフローは以下を制御する必要があります。

• RNase の汚染。

• 処理時間。

• 温度;

• 条件を緩和する。

• サンプルの安定化。

• ゲノム DNA の汚染。

• 低分子RNAの回収。

ゲノム DNA に対して優れた性能を発揮する製品でも、トータル RNA またはマイクロ RNA の最適な回収が自動的に行われない場合があります。

シリカ磁気ビーズと互換性のあるサンプルの種類

シリカ磁気ビーズは、以下の方法に組み込むことができます。

• 全血。

• 血清;

• プラズマ;

• 口腔スワブ;

• 鼻と喉のぬぐい液。

• 唾液;

• 培養細胞;

• 動物組織;

• 植物組織。

• 細菌;

• 菌類;

• ウイルス輸送媒体。

• スツール;

• 土壌;

• 食品サンプル;

• 牛乳;

• 廃水;

• 環境サンプル。

• ホルマリン固定素材。

• 無細胞 DNA サンプル。

各サンプル タイプには、適切な以下が必要です。

• 溶解法；

• 阻害剤除去戦略。

• 結合化学;

• 洗浄システム。

• 溶出状態。

磁気ビーズは、完全な抽出ワークフローの 1 つのコンポーネントにすぎません。

磁気ビーズ抽出の手動と自動の比較

通常、自動化の前に、堅牢な手動プロセスを確立する必要があります。

プロメガでは、まず必要な収率、純度、処理基準を満たす手動の磁性粒子抽出を開発し、次にそれを自動化開発中の対照として使用することをお勧めします。

磁気ロッド システム vs 液体ハンドリング システム

2 つの一般的な自動化アーキテクチャが使用されます。

磁気ロッドまたは粒子移動システム

磁気ロッドがビーズを収集し、異なる試薬を含むウェル間でビーズを物理的に移動させます。

次のような利点があります。

• 液体の移動が制限されている。

• 繰り返し吸引する必要性が減少します。

• 効率的なビードの動き。

• 事前に充填された試薬の互換性。

重要なビーズの特性には次のものがあります。

• 強力な磁気応答。

• ロッドからビードを確実にリリース。

• 良好な再分散性。

• 不可逆的な凝集が少ない。

液体処理システム

ピペッティング システムが液体を追加または除去している間、ビーズはチューブまたはプレート内に残ります。

次のような利点があります。

• 柔軟な試薬量。

• オープンプロトコルとの互換性。

• 他のサンプル調製ステップとの統合。

• 高密度プレートフォーマット。

重要なビーズの特性には次のものがあります。

• 一貫した塗布。

• ピペッティング中の沈降が少ない。

• 素早い固定化。

• 低吸引キャリーオーバー。

• 自動混合に対する応答性が良好です。

プロメガは、粒子移動ロボットと液体処理ロボットの両方を主要な自動抽出フォーマットとして説明しています。

シリカ磁気ビーズ vs スピンカラム

シリカ磁気ビーズ とシリカスピンカラムは関連する固相結合化学を使用しますが、その取り扱いは異なります。

プロメガは、シリカ磁性粒子を、溶液中で結合が起こり、洗浄中に粒子が完全に再分散できる移動固相であると説明しています。

磁気ビーズは、多くの場合、自動化された高スループットまたは可変容量のワークフローに好まれます。

スピンカラムは、簡単で低スループットの手動精製に引き続き役立ちます。

シリカ磁気ビーズ vs カルボキシル磁気ビーズ

シリカと カルボキシル磁気ビーズは 両方とも核酸ワークフローで使用できますが、すべてのプロトコルで互換性があるわけではありません。

この区別は絶対的なものではありません。市販の配合は異なり、両方の表面がいくつかの用途に適合する場合があります。

ただし、シリカコーティングビーズは通常、複雑な生サンプルからの核酸の抽出に関連しますが、カルボキシル化 SPRI タイプの粒子は PCR クリーンアップ、NGS ライブラリーのクリーンアップ、およびフラグメントサイズの選択に広く使用されます。 Beckman Coulter は、SPRI テクノロジーを、ビーズの化学的性質とバッファー条件によって制御される可逆的な核酸結合であると説明しています。

シリカ磁気ビーズの選び方

ビーズのサプライヤーは、物理仕様と機能抽出データの両方を使用して評価する必要があります。

1. 粒子サイズ

考慮する：

• 表面積;

• 磁気収集時間。

• 沈降;

• 分注精度。

• ビーズキャリーオーバー。

• 自動化プラットフォーム。

2. 粒度分布

リクエスト：

• 平均直径;

• 履歴書;

• PDI;

• D10;

• D50;

• D90;

• 測定方法。

3. 磁気応答

評価する：

• 収集時間。

• マグネット式。

• サンプル量;

• ビーズ濃度;

• 上清中にビーズが残っている。

• 回収後の再分散。

4. 磁気コンテンツ

磁性含有量が高くなると応答が改善される可能性がありますが、シリカ表面の相対的な割合が減少したり、密度が増加したりする可能性があります。

この仕様は、機能抽出パフォーマンスと合わせて解釈される必要があります。

5. シリカ表面

以下について質問してください:

• シリカコーティング法。

• 表面水酸基;

• 表面積;

• 気孔率;

• コーティングの安定性。

• ロットの一貫性。

6. 結合能力

結合能力は、定義された条件下で測定する必要があります。

精製された DNA の理論上の能力は、以下の分野でのパフォーマンスを予測できない場合があります。

• 全血。

• 組織溶解物。

• スツール;

• 植物抽出物;

• ウイルス輸送媒体。

7. 再分散性

ビーズペレットは磁気収集後に一貫して再分散するはずです。

再分散性が低いと、以下が低下する可能性があります。

• 洗浄効率。

• 溶出効率;

• 自動化された一貫性。

• 使用可能な結合面。

8. サスペンションの安定性

ビーズは、分注中に濃度が変化するほど急速に沈降してはなりません。

これは、自動化されたキット充填およびマルチウェル処理において特に重要です。

9. バッチの一貫性

商用ユーザーは次の仕様をリクエストする必要があります。

• 粒子サイズ;

• 磁気応答。

• 固形分濃度;

• 表面化学;

• 結合性能。

• 抽出回収。

• ビーズキャリーオーバー。

10. OEM 機能

市販の抽出キットの場合は、メーカーが以下をサポートしているかどうかを確認してください。

• カスタム粒子サイズ;

• カスタム濃度。

• カスタムバッファ。

• カスタムパッケージ。

• バルクボリューム。

• プライベートラベル;

• 質契約。

• 変更通知;

• 予約生産ロット。

よくある問題とトラブルシューティング

トラブルシューティングでは、一度に 1 つの変数を変更し、その結果を検証済みの手動制御と比較する必要があります。

抽出パフォーマンスの評価方法

シリカ磁気ビーズは、物理的な仕様のみではなく、完全なワークフローを使用して評価する必要があります。

収率

以下を使用して、回収された核酸の総量を測定します。

• 蛍光ベースの定量化。

• 紫外線吸光度;

• qPCR;

• デジタル PCR;

• アプリケーション固有のアッセイ。

純度

一般的な吸光度比には次のものがあります。

• A260/A280;

• A260/A230。

これらの比率はタンパク質、塩、または有機物の汚染を示している可能性がありますが、単独で使用すべきではありません。

増幅性

溶出液を次の場所でテストします。

• PCR;

• RT-PCR;

• qPCR;

• デジタル PCR。

測定濃度が高くても、サンプルに阻害剤が含まれていないことは保証されません。

誠実さ

ターゲットに応じて、以下を評価します。

• ゲル電気泳動;

• フラグメント分析;

• ディン;

• リン;

• キャピラリー電気泳動;

• 長距離 PCR。

回復

既知のスパイクイン核酸を使用して回収率を計算します。

再現性

評価する：

• ラン内精度。

• 実行間の精度。

• 演算子のバリエーション。

• 楽器のバリエーション。

• ロット間の変動。

キャリーオーバーと汚染

以下を確認してください:

• 磁気ビーズのキャリーオーバー。

• ウェル間の汚染。

• 核酸の汚染。

• エアロゾル汚染;

• 残留エタノール;

• 残留カオトロピック塩。

ダウンストリーム互換性

精製された核酸は以下をサポートする必要がある場合があります。

• PCR;

• RT-PCR;

• qPCR;

• デジタル PCR;

• シーケンス;

• クローン作成;

• 制限消化;

• 結紮;

• ハイブリダイゼーション;

• ジェノタイピング。

精製核酸の応用

シリカ磁気ビーズ抽出は、以下のワークフローをサポートできます。

• 分子診断;

• 感染症検査;

• 腫瘍学;

• リキッドバイオプシー;

• 遺伝子検査;

• 薬理ゲノミクス;

• 獣医学的診断;

• 食品の安全性;

• 環境モニタリング。

• マイクロバイオーム分析;

• 法医学的検査。

• 農業バイオテクノロジー;

• NGS サンプルの準備;

• 臨床研究;

• 学術研究。

各プラットフォームには収量、純度、フラグメント長、阻害剤耐性に関する要件が異なるため、抽出方法は意図した下流用途に合わせて検証する必要があります。

RFQ に含める情報

シリカ磁気ビーズの RFQ には以下を含める必要があります。

1. 意図された用途;

2. 標的核酸;

3. サンプルの種類;

4. サンプル入力量。

5. 予想される核酸濃度。

6. 必要な粒子サイズ。

7. 好ましい粒度分布。

8. 必要な磁気収集時間。

9. ビーズ濃度;

10. 必要な結合容量。

11. 手動または自動での使用。

12. 自動化プラットフォーム。

13. 磁気ロッドまたは液体ハンドラーのワークフロー。

14. プレートまたはチューブの形式。

15. 必要な溶出量;

16. 抽出回復が必要。

17. ダウンストリームアプリケーション。

18. サンプル量;

19. パイロット注文数量。

20. 推定年間需要。

21. 梱包要件;

22. 必要な品質文書。

23. 有効期限の要件。

24. 保管条件;

25. OEM またはプライベート ラベルの要件。

26. ロット予約の要件。

27. 変更通知の要件。

商用顧客は、次の目標仕様も提供する必要があります。

• 収率;

• 純度;

• Ct値;

• 阻害剤の除去;

• ビーズキャリーオーバー。

• 処理時間。

• スループット;

• ロット間の変動。

よくある質問

シリカ磁気ビーズは何に使用されますか?

これらは主に、生物学的および環境サンプルから DNA または RNA を抽出および精製するために使用されます。

シリカ磁気ビーズはどのようにして DNA を捕捉するのでしょうか?

結合バッファーは、DNA がシリカ表面に可逆的に吸着できるように、高塩分と水和の低下した条件を作り出します。

シリカビーズはRNAに結合しますか?

はい。シリカ表面は、適切な条件下で DNA と RNA を結合できます。

シリカ磁気ビーズは配列特異的ですか?

いいえ、標準的なシリカビーズは、特定の配列の認識ではなく、条件に依存する表面相互作用を通じて核酸に結合します。

なぜカオトロピック塩が使用されるのですか?

これらは、サンプルの溶解、タンパク質の変性、ヌクレアーゼの抑制、水和の変化、およびシリカへの核酸の結合の促進に役立ちます。

洗浄バッファーにエタノールが使用されるのはなぜですか?

エタノールは、塩、タンパク質、その他の汚染物質を洗い流しながら、核酸の結合を維持するのに役立ちます。

溶出液にエタノールが残っている場合はどうなりますか?

残留エタノールは、PCR、逆転写、ライゲーション、およびその他の酵素ベースの反応を阻害する可能性があります。

磁気ビーズを乾燥させすぎてはいけないのはなぜですか?

乾燥しすぎると、ビーズペレットの再分散が困難になり、核酸の溶出が減少する可能性があります。

DNA がシリカから剥がれる原因は何ですか?

水または低塩緩衝液は表面を再水和し、核酸をシリカに保持していた相互作用を弱めます。

シリカ磁気ビーズは小さいほうが常に優れていますか?

いいえ、ビーズが小さいほど表面積は大きくなりますが、分離が遅くなり、キャリーオーバーが発生しやすくなる可能性があります。

最適な粒子サイズはどれくらいですか?

普遍的な最適なサイズはありません。正しいサイズは、サンプル、抽出化学物質、磁気分離器、および自動化プラットフォームによって異なります。

シリカ磁気ビーズは DNA と RNA の両方を抽出できますか?

はい、ただし、選択的な DNA または RNA の精製には、最適化されたバッファーと RNase または DNase 処理が必要な場合があります。

ウイルスRNA抽出に使用できますか?

はい。シリカ磁気ビーズは、ウイルスの RNA および DNA 抽出ワークフローに一般的に組み込まれています。

cfDNA に使用できますか?

これらは cfDNA ワークフローに組み込むことができますが、少量および短いフラグメントの回収には、特別に最適化されたビーズとバッファー システムが必要です。

PCR クリーンアップに使用できますか?

はい、ただしカルボキシル化 SPRI タイプ ビーズも PCR クリーンアップやフラグメント サイズの選択に広く使用されています。

磁気ビーズ法は自動化に適していますか?

はい。磁性粒子は磁性ロッドによって操作したり、自動液体移送中に固定したりできるため、ハイスループット抽出に適しています。

磁気ビーズ法には遠心分離が必要ですか?

ほとんどの磁気ビーズのワークフローではビーズの分離に遠心分離は必要ありませんが、サンプルの調製または清澄化中に遠心分離が使用される場合もあります。

核酸収量が低い原因は何ですか?

一般的な原因には、不完全な溶解、不十分な結合条件、不適切なビーズ混合、ビーズの損失、過剰乾燥、非効率的な溶出が含まれます。

磁気ビーズのキャリーオーバーの原因は何ですか?

考えられる原因としては、磁気の収集が不十分である、磁石が弱い、吸引位置が間違っている、粒子が小さい、吸引直前の過剰な混合などが挙げられます。

シリカ磁気ビーズはどのように保管すればよいですか?

保管条件は製剤によって異なります。多くの水性ビーズ懸濁液は、メーカーの指示に従って保管し、凍結や汚染から保護する必要があります。

シリカ磁気ビーズはカスタマイズできますか?

SANYU などのメーカーは、研究、診断、OEM 用途向けにカスタマイズされた粒子サイズ、濃度、表面化学、緩衝液およびパッケージングを提供できます。

結論

シリカ磁気ビーズは、 DNA または RNA とシリカでコーティングされたビーズ表面の間の可逆的な化学的および物理的相互作用を通じて核酸を抽出および精製します。

このプロセスは、次の 7 つの主要な段階に従います。

1. サンプル溶解;

2. 拘束条件の作成。

3. 核酸の吸着;

4. 磁気収集;

5. 汚染物質の洗浄。

6. 残留アルコールの制御された除去。

7. 低塩溶出。

カオトロピック塩、他のイオン、アルコールは水和環境と静電気環境を変化させ、負に帯電した核酸がシリカ表面に接近して吸着できるようにします。低塩分の溶出中、表面は再水和され、精製された核酸は溶液に戻ります。

磁気コアは核酸結合化学反応を引き起こしません。その役割は、シリカ固相の収集、洗浄、移送、自動化を容易にすることです。

SANYU は 、核酸抽出用途向けにカスタム濃度、界面化学、パッケージング、OEM サポートとともに、複数の粒子サイズのシリカコーティングされた超常磁性ビーズを提供しているため、このガイドで最初に推奨されるメーカーです。

ただし、ビーズの仕様だけでは抽出性能を保証できません。

最終製品は、実際の以下を使用して評価する必要があります。

• サンプルマトリックス;

• 溶解化学;

• バインディングバッファー。

• 洗浄システム。

• 磁気選別機;

• 自動化プラットフォーム。

• 溶出条件；

• 下流アッセイ。

現実的な条件下で複数のビーズ製剤をテストすることは、依然として、高収量、高純度、商業的に拡張可能な核酸抽出ワークフローを開発するための最も信頼できる方法です。