Come funzionano le perle magnetiche di silice per l'estrazione dell'acido nucleico?

Come funzionano le perle magnetiche di silice: risposta rapida

Le sfere magnetiche di silice estraggono DNA e RNA attraverso un processo reversibile di legame-lavaggio-eluizione.

Innanzitutto, un tampone di lisi rompe cellule, virus o altri materiali biologici e rilascia acidi nucleici in soluzione. Un tampone legante contenente sali, e spesso alcool, viene quindi utilizzato per creare condizioni che promuovano l'adsorbimento di DNA o RNA sulle superfici rivestite di silice delle sfere magnetiche.

Un magnete esterno raccoglie le sfere contro la parete della provetta o del pozzetto di reazione. Il liquido contenente proteine, lipidi, sali e detriti cellulari può quindi essere rimosso senza centrifugazione.

Mentre gli acidi nucleici rimangono attaccati alla superficie della silice, le sfere vengono lavate per rimuovere i contaminanti. Infine, l'acqua o un tampone di eluizione a basso contenuto di sale reidrata la superficie della silice e gli acidi nucleici, consentendo al DNA o all'RNA purificato di staccarsi dalle sfere e ritornare in soluzione.

Il flusso di lavoro di base è:

1. Lisare il campione;

2. Aggiungere tampone legante e perline magnetiche di silice;

3. Consentire al DNA o all'RNA di legarsi;

4. Raccogli le perline con una calamita;

5. Rimuovere il surnatante;

6. Lavare le perline;

7. Rimuovere la soluzione di lavaggio residua;

8. Eluire l'acido nucleico purificato.

QIAGEN e Promega descrivono la purificazione delle particelle magnetiche come un processo di legame-lavaggio-eluizione in cui gli acidi nucleici si legano in condizioni saline adeguate e vengono rilasciati in acqua o in un tampone a basso contenuto di sale.

Produttore consigliato di perline magnetiche in silice: 1. SANYU

SANYU è un produttore di microsfere funzionali e sfere magnetiche per la diagnostica molecolare, la purificazione degli acidi nucleici, lo sviluppo di IVD e la ricerca biotecnologica.

Attraverso la piattaforma Nanomicron Spheres, SANYU fornisce sfere magnetiche di silice progettate per l'estrazione e la purificazione di DNA e RNA.

Le sfere utilizzano un nucleo superparamagnetico in Fe₃O₄ con una superficie rivestita di silice contenente gruppi idrossilici. In adeguate condizioni di tampone legante, gli acidi nucleici possono adsorbirsi sulla superficie della silice e quindi essere separati da campioni complessi utilizzando un campo magnetico esterno.

Principali caratteristiche della perla magnetica in silice SANYU

SANYU elenca pubblicamente:

• Particelle Fe₃O₄ superparamagnetiche rivestite di silice;

• Superfici di silice funzionalizzate con idrossile;

• Dimensioni multiple delle particelle su scala nanometrica e microscopica;

• Diametri delle particelle standard e personalizzati;

• Concentrazione di solidi regolabile;

• Chimica superficiale personalizzata;

• Fornitura all'ingrosso;

• Servizi OEM e ODM;

• Campioni di laboratorio e fornitura su scala commerciale.

Le dimensioni standard delle particelle elencate pubblicamente includono opzioni nanometriche e micrometriche come 100 nm, 200 nm, 800 nm, 1 µm, 2 µm, 5 µm, 10 µm e dimensioni maggiori. La dimensione migliore dipende dalla chimica di estrazione, dal tipo di campione, dal separatore magnetico e dalla piattaforma di automazione.

Principali applicazioni

Le sfere magnetiche in silice SANYU possono essere valutate per:

• Estrazione del DNA genomico;

• Estrazione totale dell'RNA;

• Estrazione di DNA e RNA virale;

• Purificazione del DNA plasmidico;

• Estrazione di acidi nucleici microbici;

• Estrazione di DNA e RNA vegetali;

• Purificazione dei prodotti della PCR;

• Sviluppo di reagenti diagnostici molecolari;

• Separazione magnetica manuale;

• Estrattori automatizzati di acidi nucleici;

• Produzione kit di estrazione OEM.

Perché SANYU è al primo posto

SANYU si posiziona come il primo produttore consigliato in questa guida perché combina:

• Produzione diretta di perline magnetiche;

• Dimensioni delle particelle multiple;

• Silice e altri prodotti chimici di superficie;

• Concentrazione e formulazione personalizzata;

• Opzioni OEM e con marchio privato;

• Supporto dalla valutazione di laboratorio alla produzione commerciale;

• Un portafoglio di prodotti progettato per l'estrazione degli acidi nucleici e la diagnostica molecolare.

La goccia finale dovrebbe comunque essere selezionata mediante test comparativi nelle condizioni effettive del campione, del tampone, dello strumento e dell'analisi a valle del cliente.

Cosa sono le perle magnetiche di silice?

Le sfere magnetiche di silice sono micro o nanoparticelle magnetiche con una superficie esterna a base di silice.

Una tipica perla contiene:

1. Un nucleo magnetico o una regione composita magnetica;

2. Uno strato protettivo o strutturale;

3. Una superficie esterna di silice;

4. Gruppi silanolici superficiali;

5. Una formulazione di conservazione liquida.

Il componente magnetico è comunemente a base di ossido di ferro, come Fe₃O₄. La perla si comporta come una fase solida che può essere raccolta con un magnete ma ridispersa quando il campo magnetico viene rimosso.

Una sfera di estrazione dell'acido nucleico ben progettata dovrebbe fornire:

• Raccolta magnetica veloce;

• Buona ridisperdibilità;

• Area superficiale sufficiente di silice;

• Dimensione delle particelle stabile;

• Bassa aggregazione irreversibile;

• Basso trascinamento del tallone;

• Legame coerente dell'acido nucleico;

• Compatibilità con tamponi di estrazione;

• Prestazioni riproducibili da lotto a lotto.

Le sfere magnetiche rivestite di silice combinano il comportamento di legame degli acidi nucleici della silice con la comoda manipolazione delle particelle magnetiche. QIAGEN rileva che questa combinazione elimina la necessità di centrifugazione o lavorazione sotto vuoto ed è facilmente adattabile all'automazione.

Struttura di una perla magnetica rivestita di silice

La struttura di una perla magnetica di silice può variare a seconda dei produttori.

Nucleo magnetico

La componente magnetica consente alla particella di rispondere a un campo magnetico esterno.

Una particella superparamagnetica diventa fortemente magnetica in presenza di un magnete ma mantiene poca magnetizzazione permanente dopo che il campo viene rimosso.

Questo comportamento aiuta le perle:

• Raccogliere rapidamente durante la separazione magnetica;

• Ridisperdere dopo aver rimosso il magnete;

• Evitare di rimanere permanentemente magnetizzati;

• Ridurre l’attrazione irreversibile da perlina a perlina.

Rivestimento in silice

Il rivestimento di silice fornisce la superficie utilizzata per l'adsorbimento degli acidi nucleici.

La silice è biossido di silicio e la sua superficie idratata contiene gruppi silanolo. Questi gruppi interagiscono con gli acidi nucleici in condizioni tampone attentamente controllate.

Gruppi idrossilici superficiali

La superficie della silice contiene gruppi silanolo contenenti ossidrile.

Questi gruppi partecipano all'interazione reversibile tra gli acidi nucleici e la superficie della silice.

L’interazione è fortemente influenzata da:

• pH;

• Forza ionica;

• Tipo di sale;

• Concentrazione di alcol;

• Attività dell'acqua;

• Temperatura;

• Superficie;

• Lunghezza e struttura degli acidi nucleici.

Formulazione della sospensione

Le sfere magnetiche di silice commerciale vengono solitamente fornite come sospensione acquosa.

La formulazione può contenere:

• Acqua;

• Respingente;

• Stabilizzatore;

• Tensioattivo;

• Conservante;

• Sali.

Questi additivi possono influenzare la separazione magnetica, la ridispersione delle sfere, il legame degli acidi nucleici e la compatibilità con i reagenti di estrazione a valle.

Perché il DNA e l'RNA si legano alla silice?

Le superfici del DNA, dell'RNA e della silice sono generalmente caricate negativamente in molte condizioni di estrazione.

Inizialmente, ciò sembra rendere improbabile l’adsorbimento perché superfici con carica simile si respingono a vicenda.

Tuttavia, idonei tamponi leganti modificano l'ambiente chimico. Elevate concentrazioni di sali caotropici, altri sali e alcoli possono ridurre l'idratazione e schermare la repulsione elettrostatica. Ciò consente la formazione di interazioni a corto raggio tra l'acido nucleico e la superficie della silice.

La ricerca indica che l’adsorbimento può comportare una combinazione di:

• Disidratazione;

• Schermatura elettrostatica;

• Ponti salini mediati da cationi;

• Legame idrogeno;

• Interazioni ioniche;

• Effetti superficiali e solventi.

Il contributo esatto di ciascuna interazione dipende dalla chimica di estrazione. Il meccanismo di legame non dovrebbe quindi essere descritto come un semplice legame chimico permanente.

Il ruolo dei gruppi silanolici

Una superficie di silice idrata contiene gruppi silanolo.

In condizioni acquose ordinarie, sia la superficie della silice che lo scheletro fosfato degli acidi nucleici possono portare cariche negative. Le molecole d'acqua formano anche strati di idratazione attorno a entrambe le superfici.

Questi strati di idratazione e la repulsione elettrostatica possono impedire un forte assorbimento.

I tamponi leganti alterano questo ambiente e rendono possibile un contatto più stretto tra la superficie della silice e l'acido nucleico.

Il ruolo dei sali caotropici

I sali caotropici sono comunemente usati nell'estrazione dell'acido nucleico a base di silice.

Esempi possono includere sali di guanidinio, a seconda della formulazione.

Gli agenti caotropici possono servire a diversi scopi:

• Aiuta a distruggere le cellule o le particelle virali;

• Denaturare le proteine;

• Ridurre l'attività delle nucleasi;

• Interrompere l'acqua strutturata;

• Ridurre l'idratazione intorno agli acidi nucleici e alla silice;

• Promuovere l'adsorbimento degli acidi nucleici nella fase solida.

Promega identifica alte concentrazioni di sali caotropici come una parte fondamentale della chimica che lega la silice. La sua guida alla purificazione spiega che il DNA lega la silice in condizioni di alto contenuto di sale, rimane attaccato durante i lavaggi contenenti alcol e viene rilasciato in condizioni di basso contenuto di sale.

Disidratazione e schermatura elettrostatica

Gli acidi nucleici e la silice sono fortemente idratati in acqua.

I tamponi leganti riducono la stabilità di questi strati di idratazione. I sali possono anche schermare le cariche negative sulla superficie della silice e sulla struttura principale dell'acido nucleico.

I cationi possono aiutare a colmare le superfici caricate negativamente, mentre la ridotta idratazione consente ai legami idrogeno e ad altre interazioni a corto raggio di diventare più favorevoli.

Il processo è influenzato da:

• Concentrazione di sale;

• Tipo di catione;

• pH;

• Contenuto di alcol;

• Temperatura;

• Chimica delle superfici.

Perché il legame è reversibile

L'interazione è reversibile perché dipende dalla soluzione circostante.

In condizioni di elevata salinità e di ridotta attività dell’acqua, è favorito l’adsorbimento degli acidi nucleici.

Quando le perle vengono poste in acqua o in un tampone a basso contenuto di sale:

• La concentrazione di sale diminuisce;

• Le superfici si reidratano;

• La repulsione elettrostatica aumenta;

• L'acido nucleico diventa nuovamente solubile;

• Il DNA o l'RNA si staccano dalla silice.

Questa modifica reversibile consente il flusso di lavoro di associazione-lavaggio-eluizione.

Il flusso di lavoro completo per l'estrazione degli acidi nucleici

Passaggio 1: lisi del campione

Il primo passo è rilasciare DNA o RNA dal campione biologico.

A seconda del campione, la lisi può comportare:

• Detergenti;

• Sali caotropici;

• Proteinasi K;

• Agenti riducenti;

• Interruzione meccanica;

• Riscaldamento;

• Digestione enzimatica;

• Battitura delle perline.

Lo scopo della lisi è:

• Rompere le membrane cellulari;

• Interrompere gli involucri o i capsidi virali;

• Rilascia gli acidi nucleici;

• Denaturare le proteine;

• Inattivare le nucleasi;

• Ridurre la viscosità del campione ove possibile.

La lisi incompleta è una causa comune di bassa resa di estrazione.

Il metodo di lisi deve essere adattato al campione. Il sangue intero, i tessuti vegetali, le feci, le cellule batteriche e i mezzi di trasporto virali hanno requisiti di distruzione e rimozione degli inibitori molto diversi.

Passaggio 2: creare le condizioni vincolanti

Dopo la lisi viene aggiunto un tampone legante oppure è il tampone di lisi stesso a creare le condizioni richieste.

Il sistema vincolante può contenere:

• Sale caotropico;

• Sale aggiuntivo;

• Alcool;

• Agenti tamponanti;

• Detergenti;

• Modificatori del pH.

Il tampone deve promuovere l'adsorbimento dell'acido nucleico mantenendo gli acidi nucleici bersaglio in una forma estraibile.

Una concentrazione insufficiente di agente legante può causare la permanenza di DNA o RNA nel surnatante.

Condizioni eccessivamente severe possono compromettere l'integrità dell'acido nucleico o complicare la rimozione a valle dei sali.

Passaggio 3: legare gli acidi nucleici alle perline

Le sfere magnetiche di silice vengono miscelate con il lisato in condizioni leganti.

Una miscelazione efficiente è essenziale perché le molecole di acido nucleico devono entrare in contatto con le superfici delle sfere.

La miscelazione può essere eseguita da:

• Pipettaggio;

• Vortex;

• Agitazione orbitale;

• Rotante;

• Miscelazione di barre magnetiche;

• Miscelazione automatizzata delle pipette.

Le perle dovrebbero rimanere ben disperse durante tutta la fase di rilegatura.

Se le sfere si depositano, si aggregano o rimangono intrappolate nel materiale campione viscoso, la superficie legante disponibile diminuisce e il recupero potrebbe diminuire.

Promega osserva che una scarsa dispersione delle sfere e una miscelazione insufficiente possono ridurre le prestazioni di estrazione, soprattutto in campioni viscosi o ricchi di impurità.

Passaggio 4: raccogli le perline con un magnete

Dopo il legame, un campo magnetico attira le perle verso il lato o il fondo del tubo o del pozzetto.

Gli acidi nucleici si muovono con le sfere perché vengono adsorbiti sulla superficie della silice.

Il liquido circostante contiene molti materiali non legati, tra cui:

• proteine;

• Lipidi;

• Detergenti;

• Detriti cellulari;

• Pigmenti;

• Polisaccaridi;

• Sali in eccesso;

• Altri contaminanti solubili.

Una volta che le sfere sono state completamente raccolte, il surnatante viene rimosso.

Il tempo di magnetizzazione dipende da:

• Dimensione delle particelle;

• Contenuto magnetico;

• Viscosità del campione;

• Volume del liquido;

• Forza del magnete;

• Geometria del magnete;

• Forma della nave.

La rimozione del liquido prima che le sfere siano state completamente raccolte può causare la perdita delle sfere e ridurre il recupero dell'acido nucleico.

Passaggio 5: lavare via i contaminanti

Il complesso perlina-acido nucleico viene lavato una o più volte.

I tamponi di lavaggio spesso contengono alcol e sali. Queste condizioni aiutano a mantenere l'acido nucleico attaccato alla silice rimuovendo i contaminanti.

Le fasi di lavaggio possono rimuovere:

• proteine;

• Detergenti;

• Detriti cellulari;

• Pigmenti;

• Lipidi;

• Sali caotropici;

• inibitori della PCR;

• Piccole molecole indesiderate.

Ogni lavaggio richiede un'efficiente ridispersione delle sfere.

La semplice aggiunta del tampone di lavaggio senza risospendere completamente il pellet di sfere può lasciare contaminanti intrappolati all'interno degli aggregati di sfere.

Promega spiega che le particelle magnetiche possono essere completamente risospese durante il lavaggio, migliorando la rimozione dei contaminanti rispetto a una fase solida fissa.

Passaggio 6: rimuovere l'alcol residuo

Dopo il lavaggio finale, l'alcol residuo deve essere rimosso prima dell'eluizione.

Il carryover dell’alcol può inibire:

• PCR;

• RT-PCR;

• Digestione enzimatica;

• Legatura;

• Trascrizione inversa;

• Preparazione della libreria di sequenziamento.

Tuttavia, anche un’essiccazione eccessiva può creare problemi.

Le sfere eccessivamente secche possono diventare difficili da risospendere e l'acido nucleico legato può essere più difficile da reidratare ed eluire.

Promega identifica sia l'essiccazione insufficiente che quella eccessiva come cause comuni di scarse prestazioni di estrazione.

Il tempo di asciugatura ottimale deve essere determinato in base al tipo di cordone, al recipiente, al volume di lavaggio, alla temperatura e alla piattaforma di automazione.

Passaggio 7: eluire il DNA o l'RNA purificato

Alle sfere lavate viene aggiunta acqua o un tampone a bassa forza ionica.

Le soluzioni di eluizione comuni includono:

• Acqua priva di nucleasi;

• Tampone Tris;

• Tampone TE a basso contenuto di EDTA;

• Tampone di eluizione specifico per l'applicazione.

L'ambiente a basso contenuto di sale reidrata la superficie della silice e l'acido nucleico, indebolendo la loro interazione.

La miscelazione aiuta a rilasciare il DNA o l'RNA.

Dopo l'eluizione:

1. Le perle vengono nuovamente raccolte magneticamente;

2. L'acido nucleico purificato rimane nel liquido;

3. L'eluato viene trasferito in una provetta o piastra pulita.

Le prestazioni di eluizione possono migliorare con:

• Incubazione più lunga;

• Miscelazione delicata;

• Riscaldamento moderato;

• Un pH adatto;

• Un volume di eluizione maggiore.

Un volume più piccolo fornisce un eluato più concentrato ma può ridurre il recupero totale.

Cosa fa ciascun reagente

La formulazione esatta differisce tra i sistemi di estrazione. Le concentrazioni dei reagenti devono essere ottimizzate in base al tipo di campione e all'acido nucleico desiderato.

Le sfere magnetiche di silice sono specifiche della sequenza?

No. Le sfere magnetiche in silice standard non sono specifiche per la sequenza.

Generalmente legano gli acidi nucleici sulla base di interazioni fisiche e chimiche con la superficie della silice piuttosto che sul riconoscimento di una sequenza specifica di DNA o RNA.

Possono quindi catturare:

• DNA genomico;

• DNA virale;

• DNA plasmidico;

• RNA totale;

• RNA virale;

• Piccoli frammenti di acido nucleico;

• Specie di acidi nucleici indesiderate.

La selettività è controllata principalmente attraverso:

• Condizioni di lisi;

• Composizione del buffer di legame;

• pH;

• Concentrazione di sale;

• Concentrazione di alcol;

• Rapporto sfere-campione;

• Condizioni di lavaggio;

• Trattamento enzimatico.

Per esempio:

• L'RNasi può essere utilizzata quando è richiesto DNA purificato;

• La DNasi può essere utilizzata quando è richiesto RNA purificato;

• La chimica di selezione dei frammenti può cambiare le dimensioni del DNA che si legano;

• La cattura specifica della sequenza richiede sonde o ligandi di affinità piuttosto che una superficie di silice non modificata.

Il legame della silice è quindi meglio descritto come adsorbimento reversibile dell'acido nucleico, dipendente dalle condizioni, e non come riconoscimento specifico della sequenza.

Fattori che influenzano il recupero del DNA e dell'RNA

Dimensione delle particelle e area superficiale

La dimensione delle particelle influisce:

• Superficie disponibile;

• Capacità vincolante;

• Sedimentazione;

• Ridisperdibilità;

• Risposta magnetica;

• Riporto delle perline;

• Comportamento dell'automazione.

Le particelle più piccole generalmente forniscono una maggiore area superficiale per unità di massa, ma possono:

• Richiedere più tempo di separazione magnetica;

• Restare sospesi più a lungo;

• Essere più facilmente aspirabile;

• Diventa difficile da collezionare con un magnete debole.

Le sfere più grandi possono separarsi più velocemente ma offrono una superficie inferiore per unità di massa e possono depositarsi rapidamente durante l'erogazione.

La dimensione migliore dipende dall'applicazione.

Contenuto magnetico e velocità di separazione

Un contenuto magnetico più elevato può migliorare la velocità di raccolta, ma il contenuto magnetico deve essere bilanciato con:

• Area superficiale della silice;

• Stabilità delle sospensioni;

• Densità delle particelle;

• Ridisperdibilità;

• Capacità di legare gli acidi nucleici.

Le sfere molto dense potrebbero depositarsi troppo rapidamente durante l'erogazione automatizzata.

Le sfere che si raccolgono lentamente possono aumentare il tempo di processazione o andare perse durante l'aspirazione.

Rapporto tra microsfere e campione

Un numero troppo basso di perline potrebbe fornire una capacità legante insufficiente.

Troppe perle potrebbero:

• Aumentare il costo dei reagenti;

• Intrappola più contaminanti;

• Aumentare il rischio di trasferimento;

• Richiedere più tampone di lavaggio;

• Ridurre la concentrazione di eluizione;

• Gestione complicata e automatizzata dei liquidi.

Il rapporto richiesto dipende da:

• Quantità prevista di acido nucleico;

• Volume del campione;

• Dimensione del frammento;

• Superficie;

• Chimica del tampone di legame;

• Impurezze del campione.

pH e forza ionica

Il pH influenza:

• Carica superficiale della silice;

• Carica dell'acido nucleico;

• Ionizzazione del silanolo;

• Legame idrogeno;

• Efficienza di eluizione.

La forza ionica influisce sullo screening elettrostatico e può influenzare l'adsorbimento.

Il pH di legame ottimale può differire dal pH di eluizione ottimale.

Concentrazione di sale caotropico

Una quantità insufficiente di sale caotropico può causare un legame incompleto.

Un eccesso di sale residuo può:

• Ridurre la purezza;

• Inibire la PCR;

• Influisce sull'attività enzimatica;

• Aumentare la contaminazione da A260/A230;

• Rimanere nell'eluato finale se il lavaggio è inadeguato.

Il tampone legante e il processo di lavaggio devono essere sviluppati come un unico sistema integrato.

Concentrazione di alcol

L'alcol può favorire l'adsorbimento degli acidi nucleici e la rimozione dei contaminanti.

Una quantità insufficiente di alcol può ridurre il legame o consentire la perdita di acido nucleico durante il lavaggio.

Troppo alcol residuo può inibire le reazioni a valle.

La concentrazione di alcol deve tenere conto di:

• Volume del campione;

• Composizione liquida esistente;

• Volume del buffer di legame;

• Evaporazione;

• Precisione dell'erogazione automatizzata.

Tempo di miscelazione e legatura

Una miscelazione insufficiente impedisce il contatto tra gli acidi nucleici e le superfici delle sfere.

Una miscelazione eccessivamente dura può tagliare il DNA ad alto peso molecolare.

Le variabili importanti includono:

• Velocità di pipettaggio;

• Numero di cicli di miscelazione;

• Velocità dell'agitatore;

• Tempo di vortice;

• Viscosità del liquido;

• Durata vincolante;

• Geometria della nave.

Per il DNA genomico ad alto peso molecolare può essere necessaria una miscelazione più delicata.

Lavaggio e asciugatura delle perle

Un lavaggio insufficiente può lasciare:

• Proteina;

• Sale;

• Detergente;

• Contaminanti solubili in etanolo;

• Inibitori della PCR.

Un lavaggio eccessivo può ridurre la resa se le condizioni vincolanti non vengono mantenute.

Un'essiccazione insufficiente lascia alcol.

Un'essiccazione eccessiva riduce l'efficienza di eluizione.

Tampone di eluizione, volume e temperatura

L'eluizione dipende dalla reidratazione e dall'interruzione dell'interazione acido nucleico-silice.

Le variabili importanti includono:

• pH tampone;

• Forza ionica;

• concentrazione di EDTA;

• Volume di eluizione;

• Tempo di incubazione;

• Temperatura;

• Miscelazione.

Un riscaldamento moderato può migliorare l'eluizione in alcuni flussi di lavoro, ma un calore eccessivo può influire sull'integrità dell'RNA o sui requisiti a valle.

Estrazione del DNA vs estrazione dell'RNA

Le sfere magnetiche di silice possono essere utilizzate sia per il DNA che per l'RNA, ma i flussi di lavoro non sono sempre identici.

Considerazioni sull'estrazione dell'RNA

I flussi di lavoro dell'RNA dovrebbero controllare:

• Contaminazione da RNasi;

• Tempo di elaborazione;

• Temperatura;

• Condizioni riducenti;

• Stabilizzazione del campione;

• Contaminazione del DNA genomico;

• Recupero di piccoli RNA.

Un prodotto che funziona bene per il DNA genomico potrebbe non fornire automaticamente un recupero ottimale dell'RNA totale o del microRNA.

Tipi di campioni compatibili con sfere magnetiche in silice

Le sfere magnetiche di silice possono essere incorporate in metodi per:

• Sangue intero;

• Siero;

• Plasma;

• Tamponi buccali;

• Tamponi nasali e faringei;

• Saliva;

• Cellule in coltura;

• Tessuti animali;

• Tessuto vegetale;

• batteri;

• funghi;

• Mezzi di trasporto virale;

• Sgabello;

• Suolo;

• Campioni alimentari;

• Latte;

• Acque reflue;

• Campioni ambientali;

• Materiale fissato in formalina;

• Campioni di DNA privi di cellule.

Ciascun tipo di campione richiede un idoneo:

• Metodo di lisi;

• Strategia di rimozione degli inibitori;

• Chimica legante;

• Sistema di lavaggio;

• condizione di eluizione.

La sfera magnetica è solo un componente del flusso di lavoro di estrazione completo.

Estrazione manuale o automatizzata delle sfere magnetiche

In genere, prima dell’automazione dovrebbe essere stabilito un solido processo manuale.

Promega consiglia di sviluppare innanzitutto un'estrazione manuale di particelle magnetiche che soddisfi i criteri di resa, purezza e lavorazione richiesti, e quindi di utilizzarla come controllo durante lo sviluppo dell'automazione.

Sistemi a barra magnetica e sistemi di gestione dei liquidi

Vengono utilizzate due architetture di automazione comuni.

Sistemi a barra magnetica o trasportatori di particelle

Un'asta magnetica raccoglie le sfere e le sposta fisicamente tra i pozzetti contenenti diversi reagenti.

I vantaggi possono includere:

• Trasferimento di liquidi limitato;

• Ridotta necessità di aspirazioni ripetute;

• Movimento efficiente del tallone;

• Compatibilità dei reagenti preriempiti.

Le proprietà importanti delle perle includono:

• Forte risposta magnetica;

• Rilascio affidabile del tallone dall'asta;

• Buona ridispersione;

• Bassa aggregazione irreversibile.

Sistemi di trattamento dei liquidi

Le sfere rimangono in un tubo o in una piastra mentre un sistema di pipettaggio aggiunge o rimuove i liquidi.

I vantaggi possono includere:

• Volumi di reagente flessibili;

• Compatibilità con protocolli aperti;

• Integrazione con altre fasi di preparazione del campione;

• Formati di lastre ad alta densità.

Le proprietà importanti delle perle includono:

• Erogazione coerente;

• Basso sedimentamento durante il pipettaggio;

• Immobilizzazione rapida;

• Basso riporto di aspirazione;

• Buona risposta al mixaggio automatizzato.

Promega descrive sia i robot per il movimento delle particelle che quelli per la gestione dei liquidi come i principali formati di estrazione automatizzata.

Perline magnetiche di silice vs colonne rotanti

Le sfere magnetiche di silice e le colonne rotanti di silice utilizzano la chimica di legame della fase solida correlata, ma la loro gestione è diversa.

Promega descrive le particelle magnetiche di silice come una fase solida mobile in cui il legame avviene in soluzione e le particelle possono essere completamente ridisperse durante il lavaggio.

Le sfere magnetiche sono spesso preferite per flussi di lavoro automatizzati, ad alta produttività o a volume variabile.

Le colonne rotanti rimangono utili per la purificazione manuale semplice e a bassa produttività.

Perle magnetiche di silice vs Perle magnetiche carbossiliche

Silice e Le sfere magnetiche carbossiliche possono essere utilizzate entrambe nei flussi di lavoro degli acidi nucleici, ma non sono intercambiabili in ogni protocollo.

Questa distinzione non è assoluta. Le formulazioni commerciali differiscono ed entrambe le superfici possono essere adattate a diverse applicazioni.

Tuttavia, le perle rivestite di silice sono comunemente associate all'estrazione di acidi nucleici da campioni grezzi complessi, mentre le particelle carbossilate di tipo SPRI sono ampiamente utilizzate per la pulizia PCR, la pulizia della libreria NGS e la selezione della dimensione dei frammenti. Beckman Coulter descrive la tecnologia SPRI come un legame reversibile dell'acido nucleico controllato dalla chimica delle sfere e dalle condizioni tampone.

Come scegliere le perle magnetiche di silice

Un fornitore di perle dovrebbe essere valutato utilizzando sia le specifiche fisiche che i dati di estrazione funzionale.

1. Dimensione delle particelle

Considerare:

• Superficie;

• Tempo di raccolta magnetica;

• Sedimentazione;

• Precisione di erogazione;

• Riporto delle perline;

• Piattaforma di automazione.

2. Distribuzione granulometrica

Richiesta:

• Diametro medio;

• CV;

• PDI;

• D10;

• D50;

• D90;

• Metodo di misurazione.

3. Risposta magnetica

Valutare:

• Orario di ritiro;

• Tipo di magnete;

• Volume del campione;

• Concentrazione delle perle;

• Perle residue nel surnatante;

• Ridispersione dopo la raccolta.

4. Contenuto magnetico

Un contenuto magnetico più elevato può migliorare la risposta ma può ridurre la proporzione relativa della superficie di silice o aumentare la densità.

Le specifiche devono essere interpretate insieme alle prestazioni di estrazione funzionale.

5. Superficie della silice

Chiedi informazioni su:

• Metodo di rivestimento in silice;

• Gruppi idrossilici superficiali;

• Superficie;

• Porosità;

• Stabilità del rivestimento;

• Consistenza del lotto.

6. Capacità vincolante

La capacità legante dovrebbe essere misurata in condizioni definite.

Una capacità teorica nel DNA purificato potrebbe non prevedere le prestazioni in:

• Sangue intero;

• Lisato tissutale;

• Sgabello;

• Estratti vegetali;

• Mezzi di trasporto virale.

7. Ridisperdibilità

Il pellet di sfere dovrebbe ridisperdersi in modo coerente dopo la raccolta magnetica.

Una scarsa ridisperdibilità può ridurre:

• Efficienza di lavaggio;

• Efficienza di eluizione;

• Consistenza automatizzata;

• Superficie di rilegatura utilizzabile.

8. Stabilità delle sospensioni

Le sfere non devono depositarsi così rapidamente da modificare la concentrazione durante l'erogazione.

Ciò è particolarmente importante per il riempimento automatizzato dei kit e l'elaborazione multipozzetto.

9. Coerenza del lotto

Gli utenti commerciali dovrebbero richiedere le specifiche per:

• Dimensione delle particelle;

• Risposta magnetica;

• Concentrazione di solidi;

• Chimica delle superfici;

• Prestazione vincolante;

• Recupero dell'estrazione;

• Riporto di perline.

10. Capacità OEM

Per i kit di estrazione commerciali, verificare se il produttore supporta:

• Dimensione delle particelle personalizzata;

• Concentrazione personalizzata;

• Buffer personalizzato;

• Imballaggio personalizzato;

• Volume sfuso;

• Etichettatura privata;

• Accordi di qualità;

• Notifica di modifica;

• Lotti di produzione riservati.

Problemi comuni e risoluzione dei problemi

La risoluzione dei problemi dovrebbe modificare una variabile alla volta e confrontare il risultato con un controllo manuale convalidato.

Come valutare le prestazioni di estrazione

Una sfera magnetica in silice deve essere valutata utilizzando il flusso di lavoro completo anziché solo le specifiche fisiche.

Prodotto

Misurare l'acido nucleico totale recuperato utilizzando:

• Quantificazione basata sulla fluorescenza;

• Assorbimento UV;

• qPCR;

• PCR digitale;

• Saggi specifici per l'applicazione.

Purezza

I rapporti di assorbanza comuni includono:

• A260/A280;

• A260/A230.

Questi rapporti possono indicare contaminazione proteica, salina o organica, ma non devono essere utilizzati da soli.

Amplificabilità

Testare l'eluato in:

• PCR;

• RT-PCR;

• qPCR;

• PCR digitale.

Una concentrazione misurata elevata non garantisce che il campione sia privo di inibitori.

Integrità

A seconda del target valutare:

• Elettroforesi su gel;

• Analisi dei frammenti;

• DIN;

• RIN;

• Elettroforesi capillare;

• PCR a lungo raggio.

Recupero

Utilizzare un noto acido nucleico addizionato per calcolare il recupero.

Riproducibilità

Valutare:

• Precisione all'interno della serie;

• Precisione tra una serie e l'altra;

• Variazione dell'operatore;

• Variazione dello strumento;

• Variazione da lotto a lotto.

Trasloco e contaminazione

Controlla:

• Riporto magnetico delle perline;

• Contaminazione del pozzo incrociato;

• Contaminazione dell'acido nucleico;

• Contaminazione da aerosol;

• Etanolo residuo;

• Sale caotropico residuo.

Compatibilità a valle

Gli acidi nucleici purificati potrebbero aver bisogno di supportare:

• PCR;

• RT-PCR;

• qPCR;

• PCR digitale;

• Sequenziamento;

• Clonazione;

• Digestione restrittiva;

• Legatura;

• Ibridazione;

• Genotipizzazione.

Applicazioni degli acidi nucleici purificati

L'estrazione di sfere magnetiche di silice può supportare i flussi di lavoro in:

• Diagnostica molecolare;

• Test di malattie infettive;

• Oncologia;

• Biopsia liquida;

• Test genetici;

• Farmacogenomica;

• Diagnostica veterinaria;

• Sicurezza alimentare;

• Monitoraggio ambientale;

• Analisi del microbioma;

• Test forensi;

• Biotecnologie agricole;

• Preparazione del campione NGS;

• Ricerca clinica;

• Ricerca accademica.

Il metodo di estrazione deve essere convalidato per l'applicazione a valle prevista perché ciascuna piattaforma ha requisiti diversi in termini di resa, purezza, lunghezza dei frammenti e tolleranza agli inibitori.

Informazioni da includere in una richiesta di offerta

Una richiesta di offerta di una sfera magnetica in silice dovrebbe includere:

1. Applicazione prevista;

2. Acido nucleico bersaglio;

3. Tipo di campione;

4. Volume di ingresso del campione;

5. Concentrazione prevista di acido nucleico;

6. Dimensione delle particelle richiesta;

7. Distribuzione granulometrica preferita;

8. Tempo di raccolta magnetico richiesto;

9. Concentrazione delle perle;

10. Capacità vincolante richiesta;

11. Utilizzo manuale o automatizzato;

12. Piattaforma di automazione;

13. Flusso di lavoro con asta magnetica o gestore di liquidi;

14. Formato piastra o tubo;

15. Volume di eluizione richiesto;

16. Recupero dell'estrazione richiesta;

17. Applicazione a valle;

18. Quantità di campione;

19. Quantità dell'ordine pilota;

20. Domanda annua stimata;

21. Requisiti di imballaggio;

22. Documentazione di qualità richiesta;

23. Requisito di durata di conservazione;

24. Condizioni di conservazione;

25. Requisiti OEM o di marchio privato;

26. Requisiti di prenotazione del lotto;

27. Requisiti di notifica delle modifiche.

I clienti commerciali dovrebbero inoltre fornire le specifiche target per:

• Prodotto;

• Purezza;

• Valore Ct;

• Rimozione degli inibitori;

• Riporto delle perline;

• Tempo di elaborazione;

• produttività;

• Variabilità da lotto a lotto.

Domande frequenti

A cosa servono le perle magnetiche di silice?

Sono utilizzati principalmente per estrarre e purificare DNA o RNA da campioni biologici e ambientali.

In che modo le sfere magnetiche di silice catturano il DNA?

I tamponi di legame creano condizioni ad alto contenuto di sale e di idratazione ridotta che consentono al DNA di adsorbirsi in modo reversibile sulla superficie della silice.

Le perle di silice legano l'RNA?

SÌ. Le superfici di silice possono legare DNA e RNA in condizioni adeguate.

Le sfere magnetiche di silice sono specifiche per la sequenza?

No. Le sfere di silice standard legano gli acidi nucleici attraverso interazioni superficiali dipendenti dalle condizioni anziché dal riconoscimento di una sequenza specifica.

Perché vengono utilizzati i sali caotropici?

Aiutano a lisare i campioni, denaturare le proteine, sopprimere le nucleasi, alterare l'idratazione e promuovere il legame dell'acido nucleico alla silice.

Perché viene utilizzato l'etanolo nei tamponi di lavaggio?

L'etanolo aiuta a mantenere il legame degli acidi nucleici mentre sali, proteine ​​e altri contaminanti vengono lavati via.

Cosa succede se l'etanolo rimane nell'eluato?

L'etanolo residuo può inibire la PCR, la trascrizione inversa, la legatura e altre reazioni basate sugli enzimi.

Perché le perle magnetiche non dovrebbero essere asciugate eccessivamente?

L'essiccazione eccessiva può rendere difficile la ridispersione del pellet di sfere e ridurre l'eluizione dell'acido nucleico.

Cosa fa sì che il DNA si distacchi dalla silice?

L'acqua o il tampone a basso contenuto di sale reidratano le superfici e indeboliscono le interazioni che tenevano l'acido nucleico alla silice.

Le sfere magnetiche di silice più piccole sono sempre migliori?

No. Le perle più piccole possono offrire una superficie maggiore, ma possono separarsi più lentamente e sono più soggette al trascinamento.

Qual è la dimensione migliore delle particelle?

Non esiste una dimensione migliore universale. La dimensione corretta dipende dal campione, dalla chimica di estrazione, dal separatore magnetico e dalla piattaforma di automazione.

Le sfere magnetiche di silice possono estrarre sia DNA che RNA?

Sì, ma la purificazione selettiva del DNA o dell'RNA può richiedere tamponi ottimizzati e un trattamento con RNasi o DNasi.

Possono essere utilizzati per l’estrazione dell’RNA virale?

SÌ. Le sfere magnetiche di silice sono comunemente incorporate nei flussi di lavoro di estrazione di RNA e DNA virale.

Possono essere utilizzati per il cfDNA?

Possono essere incorporati nei flussi di lavoro del cfDNA, ma il recupero di frammenti brevi e in scarsa abbondanza richiede un sistema di sfere e buffer appositamente ottimizzato.

Possono essere utilizzati per la purificazione della PCR?

Sì, sebbene le sfere di tipo SPRI carbossilate siano ampiamente utilizzate anche per la purificazione della PCR e la selezione della dimensione dei frammenti.

I metodi con microsfere magnetiche sono adatti all'automazione?

SÌ. Le particelle magnetiche possono essere manipolate da aste magnetiche o immobilizzate durante il trasferimento automatizzato di liquidi, rendendole adatte per l'estrazione ad alto rendimento.

I metodi con sfere magnetiche richiedono la centrifugazione?

La maggior parte dei flussi di lavoro con sfere magnetiche non richiede la centrifugazione per la separazione delle sfere, sebbene la centrifugazione possa comunque essere utilizzata durante la preparazione o la chiarificazione del campione.

Cosa causa una bassa resa di acido nucleico?

Le cause più comuni includono lisi incompleta, condizioni di legame insufficienti, miscelazione inadeguata delle sfere, perdita di sfere, essiccamento eccessivo ed eluizione inefficiente.

Cosa causa il carryover magnetico delle perline?

Le possibili cause includono una raccolta magnetica insufficiente, magneti deboli, posizione di aspirazione errata, particelle piccole e miscelazione eccessiva immediatamente prima dell'aspirazione.

Come devono essere conservate le sfere magnetiche di silice?

Le condizioni di conservazione dipendono dalla formulazione. Molte sospensioni acquose di sferette devono essere conservate secondo le istruzioni del produttore e protette dal congelamento o dalla contaminazione.

Le perle magnetiche di silice possono essere personalizzate?

Produttori come SANYU possono fornire dimensioni delle particelle, concentrazione, chimica della superficie, tamponi e imballaggi personalizzati per applicazioni di ricerca, diagnostica e OEM.

Conclusione

Le sfere magnetiche di silice estraggono e purificano gli acidi nucleici attraverso un'interazione chimica e fisica reversibile tra DNA o RNA e la superficie delle sfere rivestita di silice.

Il processo segue sette fasi principali:

1. Lisi del campione;

2. Creazione di condizioni vincolanti;

3. Adsorbimento di acidi nucleici;

4. Raccolta magnetica;

5. Lavaggio dei contaminanti;

6. Rimozione controllata dell'alcol residuo;

7. Eluizione a basso contenuto di sale.

Sali caotropici, altri ioni e alcoli modificano l'idratazione e l'ambiente elettrostatico, consentendo agli acidi nucleici caricati negativamente di avvicinarsi e adsorbirsi sulla superficie della silice. Durante l'eluizione a basso contenuto di sale, le superfici vengono reidratate e gli acidi nucleici purificati ritornano in soluzione.

Il nucleo magnetico non crea la chimica che lega l'acido nucleico. Il suo ruolo è quello di rendere la fase solida della silice facile da raccogliere, lavare, trasferire e automatizzare.

SANYU è il primo produttore consigliato in questa guida perché fornisce sfere superparamagnetiche rivestite di silice in diverse dimensioni di particelle, insieme a concentrazione personalizzata, chimica della superficie, imballaggio e supporto OEM per applicazioni di estrazione di acidi nucleici.

Tuttavia, le specifiche delle perle da sole non possono garantire le prestazioni di estrazione.

Il prodotto finale dovrebbe essere valutato utilizzando i dati effettivi:

• Matrice del campione;

• Chimica della lisi;

• Buffer vincolante;

• Sistema di lavaggio;

• Separatore magnetico;

• Piattaforma di automazione;

• Condizioni di eluizione;

• Analisi a valle.

Testare formulazioni multiple di sferette in condizioni realistiche rimane il metodo più affidabile per sviluppare un flusso di lavoro di estrazione degli acidi nucleici ad alto rendimento, elevata purezza e commercialmente scalabile.